OPLC als das planare Ebenbild der HPLC – Gemeinsamkeiten und Unterschiede

Schlüsselmoleküle erkennen

von Dr. Erno Tyihak, Dr. Emil Mincsovics, Dr. Agnes M. Moricz

Die Flüssigchromatografie (Liquid Chromatography, LC) umfasst zwei elementare Techniken: die LC in der Säule und die LC in einer planaren Schicht. In der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) enthält die Trennsäule das Sorbensbett, das den Anforderungen eines Hochdrucksystems gerecht werden muss [1-3]. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der HPLC und ihrer Varianten bildet die Basis für stetige Erweiterung ihrer Anwendungsbereiche, wie auf der HPLC 2011 in Budapest in eindrucksvoller Weise demonstriert wurde [4].
Während in der HPLC die mobile Phase durch die stationäre Phase gepumpt wird, erfolgt in der Dünnschichtchromatografie (TLC) und Hochleistungs-Dünnschichtchromatografie (HPTLC) der Transport der mobilen Phase gewöhnlich durch Kapillarkräfte [5]. Um die Trenneffizienz der „Schicht-LC” zu steigern, war die Entwicklung der Ultramikrokammer (UM) der erste Schritt [6] auf dem Weg dorthin. Sie stellt eine spezielle Kombination von zwei grundlegenden konventionellen LC-Techniken dar. Die Verwendung eines Pumpensystems, um die Fließgeschwindigkeit des Eluenten und die optionalen Entwicklungsstrecken zu erhöhen und zu optimieren, wurde erstmalig mit der Entwicklung einer unter Druck stehenden Ultramikro-Kammer (PUM) [7] realisiert. Das wesentliche Kennzeichen der PUM-Kammer ist, dass sich die Adsorptionsschicht auf einer horizontalen Basisplatte befindet und vollständig von einer flexiblen Membran umgeben ist. Indem von außen Druck ausgeübt wird, wird der Dampfraum des Lösemittels über der Sorbensschicht vollständig eliminiert. Die PUM-Kammer ist das Herzstück der Overpressured Thin Layer Chromatography (OPLC, Überdruck-Schichtchromatografie) [8,9]. Für die OPLC ist es charakteristisch, dass Überdruck genutzt wird, um den Eluenten in die PUM-Kammer zu pumpen. OPLC entspricht damit quasi einer HPLC mit einer Säule, die einen rechteckigen Querschnitt aufweist und sehr viel breiter als hoch ist. Die unterschiedlichen Ausführungen der OPLC-Systeme – von der einfachen Chrompres 10 bis zum automatisierten OPLC 50-System – bieten vielfältige Optionen für analytische und präparative Trennungen von Substanzen synthetischen oder biologischen Ursprungs. Aktuelle Ergebnisse, die mit HPLC- und OPLC-Techniken erhalten wurden, eignen sich für einen Vergleich. Analogien und Unterschiede zwischen beiden Techniken können die Richtungen und Möglichkeiten zukünftiger Entwicklungen bestimmen.

Analogien zwischen HPLC und OPLC

Wird der Eluentenstrom der OPLC-Kammer mit einem Detektor mit Durchflusszelle verbunden, können die eluierten Analyten direkt online detektiert und die Fraktionen gesammelt werden. Der gesamte Chromatografieprozess kann online durchgeführt werden, indem eine Injektorschleife mit dem Lösemitteleinlass und z.B. der UV- Detektor mit dem Lösemittelauslass verbunden werden, so wie es auch in der HPLC geschieht [10]. Die Online- OPLC, eine wirkliche planare Chromatografieversion der HPLC (Abb.1), ist besonders geeignet für die direkte Kopplung mit anderen Trenn- und Detektionstechniken (z.B. OPLC-FTIR, OPLC-MS etc.). Gänzlich online „hyphenated” durchgeführte OPLC-Trennungen, d.h. mit Kopplungstechniken wie DAD-Detektion und Massenspektrometrie (OPLC-DAD-MS), wurden für die Analytik von biologisch aktiven Substanzen verwendet [11]. Abbildung 2 zeigt die Beziehung zwischen der durchschnittlichen theoretischen Trennstufenhöhe (H) und der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase (u) für OPLC-Systeme einschließlich der automatischen Einheit [12] auf. Es ist augenscheinlich, dass mit Erhöhung des externen Druckes die optimale Fließgeschwindigkeit zunimmt und der optimale Arbeitsbereich der Fließgeschwindigkeit erweitert wird. Diese Beziehung zeigt die fundamentale Analogie zwischen HPLC und OPLC ebenso wie die H-L (Bodenhöhe-Säulenlänge) Beziehung [13] auf.

Unterschiede zwischen HPLC und OPLC

In der Offline-OPLC lassen sich chemische und biologische Detektionsverfahren einsetzen, um die Chromatografiespots der getrennten Analyten nachzuweisen. Derartige Anwendungen sind in der HPLC nicht möglich. Die Effizienz und die Attraktivität der OPLC-Technik können erheblich dadurch gesteigert werden, dass verschiedene Multisysteme mit unterschiedlichen Adsorbensschichten im multimodalen Betrieb eingesetzt werden und durch die kontrollierte Flussrate des Eluenten im System. Mit der Overpressured Multilayer Chromatography (OPMLC), die auf dem Einsatz von zwei oder mehr Chromatoplatten beruht, kann eine hohe Anzahl von Analyten (50-100 oder sogar mehr) während eines Entwicklungslaufes getrennt werden [14]. Seriell gekoppelte OPMLC (auch als „long distance”-OPLC bekannt) kann für die Zunahme der Bodenzahl und die Optimierung der Auflösung gleichermaßen eingesetzt werden [15]. Um schwierigste Trennprobleme zu lösen, ist der Einsatz der multidimensionalen (MD) OPLC notwendig, wenn die Trennleistung der eindimensionalen Chromatografie nicht ausreicht, um die Verbindungen vollständig zu trennen. Ein theoretisches Modell schlägt für das Erreichen der maximalen Peakkapazität den Einsatz der 3D TLC (OPLC)-Trennung vor [16].
Ein neues allgemeines Konzept wurde für Einzel- und Multikanal-OPLC-Trennungen entwickelt; wobei eine nicht segmentierte Adsorbensschicht, aber ein Flowing Eluent Wall (FEW) genanntes Verfahren zur Segmentierung verwendet wird [17]. Für Systeme mit FEW wurde die ursprüngliche Hydraulikeinheit des OPLC-Systems so verändert, dass diese zwei Einlasskanäle für mobile Phasen hat, eine für die Probeninjektion und eine andere für die Bildung von FEWs. Der Ausgang kann mit einem Flusszelldetektor und/oder Fraktionssammler verbunden werden (Abb. 3). Die FEW-Technik als innovative technische Lösung in der Schicht-LC ermöglicht echte flüssigkeitschromatografische Multikanaltrennungen auf nicht segmentierten Adsorptionsschichten [18].

Einzigartiger Unterschied zwischen OPLC und HPLC

Adsorbensschichten bieten die einzigartige Möglichkeit biologischer Detektionsverfahren und der Untersuchung von Wechselwirkungen in In-vitro-Studien. Hingegen ist das Sorbensbett einer Säule für die biologische Detektion und die Untersuchung von Wechselwirkungen nicht geeignet, weil lebende Zellen, beispielsweise Bakterien, dort nicht wachsen können – dies ist ein entscheidender Unterschied zwischen beiden Techniken. Künftig werden Schichtsysteme, vor allem in der OPLC, wesentliche und unverzichtbare methodische Lösungen für die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung von neuen antimikrobiell und antineoplastisch wirksamen Substanzen, Biopestiziden und ähnlichen Verbindungen sein [19,20]. Die Bioautografie, welche die Anwendung von Schicht-Chromatografie mit post-chromatografischem Bioassay verbindet, gilt als das am besten geeignete Assay für die Detektion von antibiotikaähnlichen Substanzen. Obwohl die direkte Bioautografie die meistverwendete Technik der verschiedenen Varianten der Bioautografie ist, wurde die erste grundlegende Weiterentwicklung vorgestellt: Das Bio-Arena-System basiert auf direkter Bioautografie und kann eingesetzt werden, um das Potenzial der direkten biologischen Detektion in der Adsorbensschicht voll auszuschöpfen [20,21]. Ein Beispiel beschreibt die Anwendung des BioArena-Systems bei der Charakterisierung der antibiotikaähnlichen Verbindung trans-Resveratrol. Wird eine wässrige Suspension von Saccharomyces
cerevisiae für die biologische Detektion verwendet (Abb. 4), zeigt sich, dass Formaldeyd-Fängermoleküle im Kulturmedium (und im chromatografischen Fleck nach Eintauchen in das Reagens) die fungizide Aktivität von trans-Resveratrol auf der Adsorbensschicht verringern, während bei Anwesenheit von Cu(II)-Ionen, die HCHO transportieren, die fungizide Aktivität von trans-Resveratrol auf eindrucksvolle Weise gesteigert wird [22]. Der Antihefeeffekt ist somit nur scheinbar, trans-Resveratrol trägt nicht direkt zum antimikrobiellen Effekt bei. In ähnlicher Weise lassen sich andere Wirt-Parasit-Wechselwirkungen beobachten bzw. die Eigenschaften anderer Verbindungen charakterisieren (z.B. Aflatoxine [23], Paclitaxel [24]).
Die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit des BioArena-Systems zeigte sich bei der Untersuchung der antibakteriellen Aktivität von Zimtsäure. Ozon als Reaktionsprodukt des Formaldehydzyklus [25] konnte in OPLC-Zonen detektiert und indirekt bestimmt werden (mit Indigocarmin im Kulturmedium). Für Studien und Untersuchungsserien ähnlicher Reaktionen mit dem BioArena-System sind die Optionen nahezu unbegrenzt und können mit einer Vielzahl von Reagenzien, Mikroben etc. durchgeführt werden.

Schlussfolgerungen

Der Vergleich der Analogien und Differenzen zwischen HPLC und OPLC lässt die Schlussfolgerung zu, dass insbesondere den modernen OPLC-Verfahren eine ganz wesentliche Rolle zukommen wird, wie es beispielsweise die Ergebnisse mit dem BioArena-System auf eindrucksvolle Weise bestätigen. Auf der Basis von BioArena-Studien lässt sich zeigen, dass Formaldehyd und Ozon als charakteristische, endogene kleine Schlüsselmoleküle eine entscheidende Rolle im antibiotischen Effekt vieler chemischer Substanzen spielen. Daher ist es von besonderem Interesse, die Bedeutung und Funktion dieser kleinen Moleküle in der biologischen Welt zu kennen und besser zu verstehen.

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Literatur

[1] Horváth, Cs. (ed.), (1973) High Performance Liquid Chromatography, Advances and Perspectives, Vol. 1, Academic Press, New York, NY.
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[10] Mincsovics, E, Tyihák, E., in: Dallas F.A. et al. (eds.), (1988) Recent Advances in Thin-Layer Chromatography, Plenum Press, New York, p. 57.
[11] Mincsovics, E. et al., (2008) J. Planar Chromatogr. 21, 361-368.
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[18] Mincsovics, E. (2008) J. Planar Chromatogr. 21 , 97-102.
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[20] Tyihak, E et al. (2008) in: Waksmundzka-Hajnos, M. et al. (eds.) Thin-Layer Chromatography in Phytochemistry, CRC Press, Boca Raton, pp. 193-213.
[21] Tyihak, E. et al., (2003) Chem. Anal. (Warsaw) 48, 543-553.
[22] Tyihák, E. et al., (2007) Acta Pharm. Hung. 77, 53-58.
[23] Móricz Á.M. et al., (2003) J. Planar Chromatogr. 16, 417-420.
[24] Tyihák, E. et al., (2008) J. Planar Chromatogr. 21, 331-336.
[25] Tyihák E. et al., (2008) J Planar Chromatogr. 21, 77-82.

Foto: © Dr. Erno Tyihak