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Isohumulone in Bier

von Dr. Markus Martin, Dr. Frank Steiner

… Gott erhalt’s! Nachdem in der letzten Ausgabe von labor&more (05/2011) ausführlich über die verschiedenen Aspekte des Schöngeistes unter den Kulturgetränken, den Wein, berichtet wurde, wenden wir uns im ChromChat diesmal dessen bodenständigerem Begleiter zu, dem Bier. Trotz eines leichten Absatzrückgangs in letzter Zeit ist die Beliebtheit des Bieres im deutschsprachigen Raum ungebrochen. Im Jahr 2010 produzierten in Deutschland 1325 Brauereien den goldenen Gerstensaft, knapp die Hälfte davon, 637, mit Sitz in Bayern. Mit einem rechnerischen Pro-Kopf-Verbrauch von 102,1 Litern ist Bier somit noch immer das meistgetrunkene alkoholische
Getränk in Deutschland [1] – wie auch das jüngst zu Ende gegangene Münchner Oktoberfest beweist, auf dem allein 6,9 Mio. Besucher insgesamt 7,5 Mio. Maß vom berühmten „Hellen“ tranken [2].

Kulturelle Meisterleistung

Doch wenn die vermeintlichen Schattenseiten eines solchen Massenkonsums auch im übertragenen Sinne das Bild trüben können, ist Bierbrauen eine kulturelle Meisterleistung, deren Anfänge bis weit ins Altertum zurückreichen. Die ältesten erhaltenen Aufzeichnungen über die Braukunst stammen aus dem Mesopotamien der Sumerer (ca. 3000 v.Chr.) und auch die Hochkulturen, die wir heute traditionell mit dem Weinanbau verbinden, wie die Griechen und die Römer, befassten sich sehr wohl mit Bier, auch wenn gerade Letztere dem Gerstensaft eher geringschätzig gegenüberstanden. Aufgrund der raueren klimatischen Bedingungen sorgte Bier jedoch in den nördlichen Breiten Europas für weitaus mehr Furore, was sich über das Mittelalter bis in die Neuzeit gehalten hat. Dabei ist Bier bis heute ein echtes Naturprodukt, dessen Herstellung in Deutschland auf der Grundlage des deutschen Reinheitsgebotes von 1516 geregelt ist. Neben dem Malz, das in unseren Breiten vornehmlich aus Gerste gewonnen wird, Hefe und dem obligatorischen Brauwasser stellt Hopfen (Humulus lupulus) die vierte der in Deutschland gestatteten Bierzutaten dar. Seine Verwendung in der Braukunst ist seit dem Mittelalter beschrieben. Ihr lag die Beobachtung zu Grunde, dass gehopfte Biere deutlich länger haltbar sind. Zudem machte erst der angenehm bittere Geschmack des Hopfens aus manch zweifelhaftem Gebräu ein wirkliches Genussmittel. Für beide Wirkungen, Konservierung und Geschmack, sind u.a. die Bitterstoffe des Hopfens verantwortlich. Maßgeblichen Einfluss auf den Geschmack des Bieres haben dabei die Hopfensäuren (Abb. 1) der Humulone (1) und Lupulone (2). Die ?-Säuren vom Humulontyp [1] werden beim Würzkochen unter einer Acyloin-Ringkontraktion in zwei Isoformen, die cis- bzw. trans?Isohumulone, überführt (3 a, b). Folglich finden sich in Bier hauptsächlich sechs iso-?-Säuren, die aus der Konversion der drei wichtigsten ??Sauren Humulon, Cohumulon und Adhumulon stammen. Die Bestimmung ihrer Konzentrationsverteilung ist heutzutage ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle in der Bierherstellung.

Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion

Bei den Substanzeigenschaften der Bitterstoffe – polare organische Säuren – bietet sich die Flüssigchromatografie als ideale Trennmethode an. Gerade im Lebensmittelbereich mit oft sehr komplexen Matrices nimmt die Probenvorbereitung eine wesentliche Bedeutung an; hierauf entfallen der größte Arbeitsaufwand und die meisten Fehlerquellen im Gang einer Analyse. In der Bieranalytik bietet sich hierzu die Festphasenextraktion (SPE) an. Sie dient sowohl der Matrixentfernung als auch einer eventuell erforderlichen Anreicherung der Zielanalyten. In ihrer herkömmlichen Offlinevariante ist sie jedoch mit einem hohen Aufwand an manueller Arbeit und Zeit verbunden. Vor dem Anreichern muss die Festphase, üblicherweise ein Reversed-
Phase-LC-Material, konditioniert werden; anschließend wird eine definierte Menge der Bierprobe durch die SPE-Kar tusche gesaugt, gefolgt von Matrixentfernung und der Elution der Analyten. Je nach Elutionsmittel ist vor der eigentlichen chromatografischen Trennung noch ein Lösemittelwechsel erforderlich. In der Onlinevariante erfolgen diese Schritte automatisiert über eine Anreicherungsphase, die wahlweise als Kartusche oder in einer kurzen Säule mittels eines Sechswegeventils in den Flusspfad einer Beladungspumpe oder der analytischen Trennung geschaltet werden kann (Abb. 2).

Analytik – höhere Präzision durch Automatisierung

Die Beladung der Festphase (A) sowie die Regeneration (C) nach erfolgtem Probentransfer (B) auf die Trennsäule werden dabei unabhängig von der (U)HPLC-Trennung durchgeführt und können parallel zum Gang der Analyse erfolgen, was einen deutlichen Zeitgewinn bedeutet. Mittels geeigneter Regenerationsschritte ist eine Verwendung der SPE-Phase verschleppungsfrei über viele Injektionen möglich. Die Automatisierung erlaubt zudem neben der geringeren Exposition gegenüber toxischen Substanzen auch eine deutlich höhere Präzision. Viele Anwender scheuen allerdings den erweiterten Systemaufbau und die vermeintlich komplizierte Methodenprogrammierung für eine solche Systemlösung. Diesen Vorbehalten begegnet Thermo Fisher Scientific mit der integrierten Dionex UltiMateTM 3000 Online-SPE-Kitlösung. Basierend auf der einzigartigen Dual- Gradientenpumpe DGP-3600RS, die zwei unabhängig steuerbare ternäre Niederdruckgradientenpumpen in einem Modulgehäuse vereint, erlaubt diese Komplettlösung einen bewusst einfach gehaltenen Systemaufbau mit allen benötigten Einzelteilen. Spezielle SPE-Phasen mit Druckstabilitäten von bis zu 800 bar bieten Online-SPE auch im UHPLC- Bereich und maßgeschneiderte Softwareassistenten machen die Methodenprogrammierung so einfach wie nie zuvor. Auf dieser Grundlage wurde eine UPHLC-Trennung mit integrierter Online-SPE-Probenvorbereitung zur Bestimmung der Isohumulone in Bieren ausgearbeitet. Als Festphase kommt mit dem Thermo Scientific Dionex SolExTM HRP ein spezielles Mischpolymermaterial zum Einsatz, das hydrophile und hydrophobe Eigenschaften ausgewogen kombiniert und zudem druckstabil bis 800 bar ist. Diese sehr effektive Applikation hat bereits ihre Praxistauglichkeit in verschiedenen Brauereien unter Beweis gestellt. Abbildung 3 zeigt einen Vergleich zwischen einer Direktinjektion einer Weißbierprobe und dem Online- Testphasenextraktionsexperiment. Deutlich ist die Reduktion der Matrixfracht durch die Online-SPE zu erkennen. Dies verbessert die Quantifizierung der Isohumulone, da deren Peaks nicht mehr im lang auslaufenden Tailing des Matrixsignals, sondern bei ebener Basislinie detektiert werden und schont nebenbei auch die analytische Trennsäule, die deutlich weniger kontaminiert wird. Bei Bedarf kann die Matrix auch im Bypass in den Abfall geführt werden, was einer möglichen Kopplung der Methode mit der Massenspektrometrie zugutekommt. Abbildung 4 wiederum stellt eine Auswahl verschiedener Biersorten gegenüber. Deutlich zu erkennen sind die hohen Gehalte an Bitterstoffen in einem bewusst als „friesisch herb“ beworbenen Pilsbier, während obergärige Lagerbiere sichtbar weniger Humulone aufweisen. Einen schönen Kontrast bietet ein Malzbier, in dem Bitterstoffe nur in geringen Mengen nachweisbar sind. Hier ist hingegen die Matrixfracht erheblich, was nicht zuletzt auf die zugesetzten Farb- und Süßstoffe wie Zuckerkulör zurückzuführen ist und die Notwendigkeit einer Probenvorbereitung für eine robuste Analysenmethode unterstreicht.

Fazit

Die hier vorgestellte Applikation belegt eindrucksvoll, dass integrierte Probenvorbereitung und UHPLC-Trennungen auch den Anforderungen des Lebensmittelsektors ohne Weiteres gewachsen sind. Ihre Robustheit und Automatisierung haben mittlerweile einen Reifegrad erreicht, der den problemlosen Einsatz auch unter den verschärften Bedingungen von komplexen Matrices im Produktionsumfeld erlaubt.

Um die Abbildungen zu sehen, laden Sie sich bitte das PDF (rechts oben) runter.

Foto: © Dr. Markus Martin