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Neue Wege des Proteindesigns nach dem Vorbild viraler Proteine

Meister der Minimal Art

Minimal Art ist eine Bewegung in der modernen Kunst der 60er-Jahre, die versucht hat, mit wenig Material maximale emotionale Eindrücke zu erzielen. Übertragen auf die Biologie sind sicherlich Viren die Meister der Minimal Art; sie haben im Verlauf der Evolution Proteine für ihre Replikation designed, die oft extrem klein sind und dennoch funktionell sehr effizient. Eine Klasse von solchen kleinen viralen Proteinen, deren funktionelle Bedeutung für Viren überhaupt erst in den vergangenen Dekaden entdeckt wurde, sind Ionenkanäle. Diese kleinen Membranproteine bilden tunnelartige Strukturen in Membranen und erlauben damit den raschen Durchtritt von Ionen über Membranbarrieren.

Vertreter von viralen Kanalproteinen findet man bei vielen Viren, die medizinisch hoch relevant sind. Dazu gehören das Influenzavirus A (IVA), das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) und das Hepatitisvirus C (HVC). In allen Fällen spielt die Kanalfunktion eine zentrale Rolle bei der Infektion bzw. Replikation dieser Viren. Deshalb werden diese Proteine sehr intensiv untersucht, da sie als ein ideales Target für die Entwicklung von antiviralen Medikamenten angesehen werden.

K+-Kanäle aus Viren

Während die meisten viralen Kanalproteine keinerlei strukturelle Ähnlichkeit zu Kanälen aus höheren Organismen wie Pflanzen oder Tieren aufweisen, hat man vor ca. 15 Jahren in Viren, die einzellige Algen infizieren, Gene gefunden, die für Kanalproteine codieren, die denen aus höheren Organismen sehr ähnlich sind [1]. Ein Strukturvergleich zeigt, dass die viruscodierten Proteine alle essenziellen Eigenschaften von ­typischen K+-Kanälen haben, wie sie auch in Nerven- und Muskelzellen von Menschen aktiv sind. Nach dem Prinzip der Minimal Art, das so perfekt von den Viren realisiert wird, sind die viralen Kanäle jedoch wiederum viel kleiner als ihre Äquivalente in Tieren und Pflanzen. Während die Untereinheit eines K+-Kanals in humanen Zellen aus ca. 400 bis 800 Aminosäuren aufgebaut ist, beschränkt sich die Größe der viralen Kanäle auf weniger als 100 Aminosäuren. Ausgiebige funktionelle Analysen haben gezeigt, dass die Proteine trotz der geringen Größe noch Kanalaktivität aufweisen und sogar die wesentlichen funktionellen Eigenschaften von komplexen K+-Kanälen haben [1]. Dazu gehört eine ausgeprägte Selektivität für den Transport von K+-Ionen gegenüber den kleineren Na+-Ionen.


Abb.1 Snapshot aus einer MD-Simulation des KcvATCV-1-Kanals in einer POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)-Membran. Die vier Monomere des Kanals sind in unterschiedlichen Farben dargestellt. Bild: Stefan Kast, Uni Dortmund

Inzwischen wurden nahezu 100 verschiedene K+-Kanäle aus Viren isoliert, die sich bezüglich ihrer Struktur und Funktion in interessanten Aspekten unterscheiden [2]. Erwähnenswert hier ist die Tatsache, dass bei der Suche nach neuen Kanälen auch noch immer kleinere Kanalpro­teine entdeckt wurden. Während der zuerst entdeckte Kanal Kcv aus dem Paramecium bursaria chlorella-Virus 1 mit 94 Aminosäuren schon als extrem klein empfunden wurde, war es inzwischen möglich, noch kleinere Vertreter zu charakterisieren. Abbildung 1 zeigt die Moment­aufnahme aus einer molekulardynamischen Simulation eines viralen Kanals aus dem ATCV-1-Virus [3]. Typisch für K+-Kanäle ist, dass der funktionelle Kanal aus einem Tetramer gebildet wird. Während der Kcv-Kanal noch 94 Aminosäuren pro Monomer aufweist, ist der Kanal KcvATCV-1 in Abbildung 1 aus nur 82 Aminosäuren gebaut [3]. Während in diesem Fall das Protein schon fast in der Membran versinkt und der Eindruck entsteht, dass mit dieser Größe das Minimum erreicht ist (Abb. 1), wurde kürzlich ein noch kleineres virales Kanalprotein entdeckt [2]. Dieses Protein stammt aus einem Virus, das im Meer sehr kleine Algen aus dem sogenannten Picoplankton infiziert. Mit nur 78 Aminosäuren pro Monomer ist dieser Kanal noch kleiner als der in Abbildung 1 gezeigte, aber trotz der kleinen Dimension immer noch als K+-Kanal funktionell [2]. Weitere Untersuchungen über Struktur-/Funktionskorrelate werden zeigen, wie das Prinzip der Minimal Art, in diesem Fall in der Interaktion zwischen Protein und Lipidmembran, realisiert wird und was als minimales molekulares ABC für einen funktionellen K+-Kanal notwendig ist.


Abb.2 Expression der beiden viralen K+-Kanäle Kcv und Kesv als Chimäre mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) in HEK293-Zellen. Die Bilder zeigen eine Überlagerung von konfokalen Bildern, in denen zum einen die rote Fluoreszenz von einem Markerprotein, das spezifisch in die Mitochondrien sortiert wird, und zum anderen die grüne Fluoreszenz der Kanalchimäre registriert wird. Im Falle von Kcv sind beide Fluoreszenzsignale deutlich getrennt, während sie sich im Fall von Kesv überlagern und ein gelbes Signal generieren. Maßstab 2 µm.Daten von Dr. Charlotte von Chappuis, TU Darmstadt

Wo kommen sie denn her?

Sehr interessant im Zusammenhang mit den ­viralen K+-Kanälen und ihrer Ähnlichkeit zu ­Kanälen aus höheren Organismen ist die Frage nach ihrem Ursprung. Die konventionelle Vorstellung ist, dass Viren als molekulare Piraten Gene von ihren Wirtszellen entwenden und für ihre eigene Zwecke nutzen. Wenn das so ist, dann sollten die Gene der viralen Kanäle eine höhere Ähnlichkeit mit Genen für K+-Kanäle aus ihrem Wirt haben als untereinander. Da zwei Wirte von Viren, die K+-Kanalgene tragen, inzwischen vollständig sequenziert wurden, konnte diese Hypothese getestet werden. Ein ausgiebiger bioinformatischer Vergleich von Kanal­sequenzen aus Viren bzw. aus Wirtszellen zeigt jedoch, dass die viralen Kanäle untereinander eine höhere Ähnlichkeit haben als zu irgendeinem Wirtsgen [4]. Die Schlussfolgerung daraus ist, dass die Familie der Algenviren, die sich durch ein großes Genom aus doppelsträngiger DNA auszeichnet, in Vorzeiten einen gemeinsamen Wirt hatte, der nicht mehr existiert. Auch eine radikalere Interpretation ist möglich, nach der diese Viren selbst die vierte Domäne des Lebens sind und damit möglicherweise sogar der Ursprung von Genen für K+-Kanäle in höheren Organismen [4]. Für die Hypothese, nach der in der Evolution auch ein Gentransfer von Viren zu höheren Organismen stattgefunden ­haben könnte, gibt es immer mehr unterstützende Befunde.

Überraschungen bei der Proteinsortierung

Die experimentellen Arbeiten mit viralen K+-Kanälen stecken voller Überraschungen. Nachdem aus Viren, die aus dem Süßwasser gewonnen wurden, schon mehrere K+-Kanäle isoliert worden waren, die alle in Zellen funktionell waren, wurde auch ein Gen für einen K+-Kanal in einem Virus entdeckt, der eine Braunalge im Meerwasser infiziert [5]. Bei Expressionsstudien zeigte sich, dass obgleich das Kesv-Protein dem Kcv-Kanal sehr ähnlich ist, das erstgenannte ­Kanalprotein nicht in den sekretorischen Weg und damit nicht zur Plasmamembran, sondern in die Mitochondrien sortiert wird (Abb. 2). In weiteren Arbeiten hat sich gezeigt, dass eine Manipulation von wenigen Aminosäuren am ­C-terminalen Ende des Proteins ausreicht, um diese Sortierung wieder umzukehren und den Kanal wie alle andern Kanäle zur Plasmamembran zu schicken [5]. Was erst einmal wie eine Kuriosität aussieht, kann eine große Bedeutung für das Verständnis von zellulären Prozessen ­haben. In der humanen Zellbiologie ist bekannt, dass mehrere Membranproteine einschließlich K+-Kanäle sowohl in der Plasmamembran als auch in den Mitochondrien zu finden sind. ­Bisher ist vollkommen unbekannt, wie diese Sortierung von sehr ähnlichen Proteinen an die beiden so unterschiedlichen Zielorte funk­tioniert. Die einfach gebauten viralen Kanäle und die Identifizierung eines Sortierungsmotivs im C-Terminus könnten ein Schlüssel sein, um dieses bisher ungeklärte Prinzip der dualen Sortierung von Proteinen molekular zu verstehen. An der Stelle sollte erwähnt werden, dass viele Dinge, die wir in zellbiologischen oder mole­kularbiologischen Lehrbüchern finden, in der Tat erst bei Viren entdeckt wurden. Viren müssen für ihre eigene Replikation Prozesse benutzen, die ihnen von ihren Wirtszellen zur Verfügung gestellt werden. Nachdem man entdeckt hatte, wie Viren in Zellen eindringen oder wie Viren ihre Membran mit der Membran in den Wirtszellen fusionieren, fand man heraus, dass auch die Wirtszellen selbst ähnliche Proteine oder Prozesse nutzen, um die gleichen Vorgänge zu bewerkstelligen.


Abb.3(A) Schematische Struktur von spannungsabhängigen Kanälen, wie sie in Nerven und Muskeln funktionieren mit einer Porendomäne (Bereich 2) und einer Sensordomäne (Bereich 1). Durch die Fusion von zwei unabhängigen Domänen, der Sensordomäne aus einer Phosphatase (rot) und dem viralen Kcv (grün) entsteht ein Kanal der die Summe der Einzelkomponenten (gelb) widerspiegelt. (B) Durch Kopplung mit der Sensordomäne wird der Kcv-Kanal, der alleine wie ein ohmscher Widerstand funktioniert (offene Symbole), zu einer Diode, die bevorzugt Auswärtsstrom leitet (geschlossene Symbole).

Ideale Basis für synthetische Kanäle

Nachdem Biologen in den vergangenen Dekaden Struktur- und Funktionsbeziehungen von einzelnen Proteinen oder Proteindomänen sehr gut verstanden haben, kam die Idee auf, in ­einer Art ingenieurwissenschaftlichen Heran­gehensweise Proteine mit neuen Eigenschaften im Labor zu kreieren. Dabei werden wie beim Bauen mit Legosteinen einzelne Proteinkomponenten verschiedener Herkunft über gentechnische Verfahren miteinander verknüpft. Idealer­weise sollte das Produkt eines solchen Proteinengineerings die funktionellen Eigenschaften von beiden Proteinkomponenten miteinander verbinden. Inspiriert von dieser Idee wurde in verschiedenen Ansätzen versucht, synthetische Ionenkanäle im Labor herzustellen. Die meisten dieser Ansätze, bei denen als Baustein eine Kanalpore aus höheren Organismen genommen wurde, erwiesen sich als wenig erfolgreich. Die Ursache dafür ist wahrscheinlich, dass die Kanalproteine aus höheren Organismen so sehr spezialisiert sind, dass sie keine Verbindung mit anderen Proteinen tolerieren. Das ist ganz anders bei den kleinen viralen K+-Kanälen. Die sehr schlichte Architektur dieser Proteine und die Tatsache, dass sie keine K­oevolution in Zellen oder mit anderen Proteinkomponenten durchlaufen haben, machen sie zu idealen Bausteinen für die Konstruktion von synthetischen Kanälen. Ein erfolgreiches Beispiel für einen solchen synthetischen Kanal ist der Nachbau eines spannungsabhängigen K+-Kanals (= Kv-Kanal) [6]. Für diese besonders wichtige Klasse von K+-Kanäle ist bekannt, dass sie im Wesentlichen aus zwei funktionellen Komponenten aufgebaut sind (Abb. 3). Eine funktionelle Komponente ist die Kanalpore, die aus den letzten zwei Transmembrandomänen und dem dazwischen gespannten Loop besteht. Die zweite funktionelle Domäne, die Sensor­domäne, wird von den ersten vier Transmembrandomänen gebildet. Wichtig hierbei ist die vierte Transmembrandomäne, die sehr viele positiv geladene Aminosäuren trägt und mit dieser Ladung das elektrische Potenzial über die Membran wahrnimmt. Sehr aktuell für das Verständnis der Funktion dieser wichtigen Proteine, die unter anderem für die Repolarisation von Aktionspotenzialen in Nerven und Muskeln verantwortlich sind, ist die Frage nach der mechanischen Kopplung zwischen der Sensor- und der Porendomäne. Um diese Frage experimentell zu beantworten, wurde mehrfach versucht, synthetische Kanäle zu bauen, die aus definierten Elementen, nämlich einer unabhängigen Pore und einer Sensordomäne, aufgebaut sind. Ein solches einfaches System sollte zeigen, wie eine Bewegung der Sensordomäne im elektrischen Feld der Membran die Schalteigenschaften der Kanalpore beeinflusst. Ein solcher synthetischer Kv-Kanal konnte nun in der Tat im Labor gebaut werden, indem der virale Kcv-Kanal, der nicht mehr ist als die Pore eines komplexen K+-Kanals, mit einer Sensordomäne für Membranspannung verbunden wurde [5]. Interessanterweise stammt die Sensordomäne nicht von einem Kanal, sondern von einer Phosphatase aus der Schlauchseescheide (Ciona intestinalis), einem sessilen Manteltier, das man im Mittelmeer findet. In der Phosphatase sorgt die Sensordomäne für eine Spannungsabhängigkeit des Enzyms. Durch die Verbindung der zwei Proteindomänen aus fremden Organismen war es möglich, den viralen K+-Kanals Kcv spannungsempfindlich zu machen. Das synthetische Protein vereinigt die funktionellen Eigenschaften der Kanalpore mit der Spannungsempfindlichkeit der Sensor­domäne [6]. Aus dem ohmschen Widerstand der Kanalpore wird eine Diode, die bevorzugt Auswärtsstrom leitet (Abb. 3). Durch Variieren der einzelnen Bauteile in dem synthetischen Kanal kann man nun systematisch untersuchen, wie die Sensoreigenschaften auf die Kanalpore übertragen werden. Hier zeichnet sich jetzt schon eine zentrale Rolle für die Länge der Verbindung zwischen den Bauteilen, dem sogenannten Linker, ab [6].

Die viralen Kanäle eignen sich jedoch nicht nur zum Nachbauen; sie können auch für den Bau von Kanälen mit ganz neuen funktionellen Eigenschaften wie z.B. einer Schaltung durch Licht verwendet werden. Ein viel beachteter ­Ansatz in der aktuellen Forschung ist die sogenannte Optogenetik. Hier werden lichtempfindliche Proteine benutzt, um in Zellen in einer nicht invasiven Art und Weise physiologische Prozesse zu steuern. Da in diesem Feld ein ­Bedarf für einen lichtschaltbaren K+-Kanal besteht und die Natur selbst keine solchen Proteine bereitstellt, wurde ein synthetischer Kanal mit diesen Eigenschaften im Labor hergestellt [7]. Dazu wurde der schon mehrfach genannte kleine virale K+-Kanal mit einer kleinen Proteindomäne aus dem Blaulichtrezeptor von Hafer gekoppelt. Nach vielen Optimierungsschritten zeigte der Kanal, der für sich genommen keine Abhängigkeit gegenüber Licht aufweist, eine Sensitivität gegenüber einem Licht/Dunkel-Wechsel. Während der Kanal im Dunkeln nur wenig aktiv ist, kann er durch Blaulicht angeschaltet werden (Abb. 4). Damit verbindet der synthetische ­Kanal wiederum die individuellen Eigenschaften der einzelnen Proteinkomponenten. Der Baulichtrezeptor aus der Pflanze sensiert spektralspezifisch Licht und überträgt eine daraus folgende Konforma­tionsänderung auf die Kanalpore [7].


Abb.4 Blaulichtinduzierter Strom in einer Xenopus Oozyte, die einen synthetischen Kanal, bestehend aus dem viralen Kanal Kcv und Teilen eines Blaulichtrezeptors aus Hafer, exprimieren. Bei einer negativen Haltespannung erzeugt blaues Licht (455nm, ca. 30µWmm-2) einen Einstrom von K+ in die Zelle; der Prozess ist reversibel im Dunkeln.
Daten von Sabrina Gazzarrini, Universität Mailand

Resümee

Der kurze Überblick sollte zeigen, wie interessant virale Proteine sind. Viren stehen unter einem großen Mutationsdruck und gleichzeitig müssen sie die Gene für essenzielle Proteine möglichst klein halten, damit das virale Genom in das begrenzte Volumen der Viruskapside passt. Diese Faktoren zusammen generieren ­eine nahezu unbegrenzte große Bibliothek an funktionellen Proteinvarianten, aus der man sehr viel über Struktur- und Funktionsbeziehungen in Proteinen lernen kann und die gleichzeitig wegen ihrer einfachen Struktur große Vorteile für ein Proteinengineering bieten.

Literatur
[1] Plugge, B. et al. (2000) Science 287, 1641–1644
[2] Siotto, F. et al. (2014) Virology 467, 103–111
[3] Braun, C.J. et al. (2014) Biochim. Biophys. Acta 1838, 1096–1103
[4] Hamacher, K. et al. (2012) PLoSOne 7, e38826
[5] Balss, J. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 12313–12318
[6] Arrigoni, C. et al. (2013) J. Gen. Physiol. 141, 389–3895
[7] Cosentino, C. et al. (2015) Science 348, 707–710

Quelle: Matthias Keil, Montreal; Aufmacherbild: Jürgen Bricmann

L&M 7 / 2015

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 7 / 2015.
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