„ Der Tod wird auf schnellen Schwingen zu demjenigen kommen, der die Ruhe des Pharao stört.“

von Dr. Markus Martin

So wurde sinngemäß der Grabspruch des Tutanchamun durch den Ägyptologen Sir Alan Gardiner übersetzt, als er im Januar 1923 [1] Howard Carters legendärer Freilegung des Tals der Könige im westlichen Theben beiwohnte. Damit schuf er ein Mysterium, das seit den 1920er-Jahren weltweit für Aufsehen und Faszination sorgt. Tatsächlich schienen sich alsbald ungewöhnliche Todesfälle unter den Teilnehmern der Grabungsaktion zu häufen, der Fluch tat offenbar seine Wirkung. Eilfertig wurde, neben allerlei abergläubischem Geschwätz, auch von ernst zu nehmenden Wissenschaftlern nach logischen Erklärungen für dieses okkulte Phänomen gesucht. So schlug man die Existenz bestimmter, giftiger Schimmelpilzsporen in der Grabluft als Erklärungsversuch vor, die, einer antiken Biowaffe gleich, den vermeintlichen Fluch als Tatsache belegen sollten.

Auch wenn der Fluch der Pharaonen zweifels ohne ins Reich der Legenden gehört und sich sämtliche rätselhaften Phänomene diesbezüglich bei genauerem Hin sehen in Luft auflösen – mit Schimmelpilz giften, allen voran den Aflatoxinen, ist nicht zu spaßen. Sie wurden erstmals in der namensgebenden Gattung Aspergillus flavus entdeckt, finden sich jedoch auch in weiteren Arten wie A. parasiticus oder A. toxicarius. Man kennt heute über 20 verschie dene Aflatoxine, von denen aber in Nahrungsmitteln nur die Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 auftreten (Abb. 1 a); B1 gilt dabei als das für Menschen gefährlichste. Aflatoxine sind zum einen akut lebertoxisch, mit letalen Dosen von 110 mg / kg Körpergewicht bei Erwachsenen, zum anderen zählen sie zu den stärksten bekannten Kanzerogenen. Im Tierversuch wurde eine Tagesdosis von nur 10 ?g Aflatoxin B1 pro kg Körpergewicht, etwa 1,3 % der entsprechenden letalen Dosis, als eindeutig krebserregend identifiziert. Dies macht deutlich, dass eine strenge Kontrolle von Aflatoxinen in der Lebensmittelüberwachung unumgänglich ist, zumal die eingangs genannten Schimmelpilzsporen nahezu überall zu finden sind. Getreide und alle daraus hergestellten Produkte wie Backwaren, Getränke oder Babynahrung sind anfällig für eine Aflatoxinkontamination, zumal die Toxine thermostabil sind und einen Back- oder Gärprozess unbeschadet überstehen können. Entsprechend streng sind die Grenzwerte, die es einzuhalten gilt: In der Europäischen Union darf der Gehalt an Aflatoxin B1 in Getreide, Nüssen oder Trockenfrüchten 2 ppb, in Babynahrung sogar 0,1 ppb nicht überschreiten – eine Herausforderung für die Analytik mittels Flüssigchromatografie (HPLC). Matrixentfernung, selektive Analytanreicherung und empfindliche Detektion sind daher die Aspekte, die es für die Spurenbestimmung zu optimieren gilt.

Probenvorbereitung – schnell und zuverlässig

Im konventionellen Analysengang wird zunächst über eine Soxhlet-Extraktion ein Rohextrakt der Nahrungsmittelprobe gewonnen, bevor dann mittels Offline-Festphasenextraktion (SPE) Matrices entfernt und die Aflatoxine angereichert werden. Die weitgehend manuelle Soxhlet-Extraktion, deren Zeitaufwand im Stundenbereich liegt, kann heutzutage sehr effektiv durch die beschleunigte Lösemittelextraktion (Accelerated Solvent Extraction mit den Thermo Scientific DionexASE Systemen) ersetzt werden. Bei diesem automatisierten Verfahren wird das Extraktionsgut in die Extraktionszelle eingefüllt und mit wählbaren Solventien unter Druck und erhöhter Temperatur extrahiert, was neben der Zeitersparnis auch eine erhöhte Reproduzierbarkeit bei geringerem Lösemittelverbrauch bedeutet. So gelingt die Rohextraktion aus 5 g Probe in nur zwei Extraktionszyklen a 5 min bei 80 °C Extraktionstemperatur und deutlich unter 20 ml Lösemittelbedarf (Abb. 2).Die Anreicherung der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2 aus dem Rohextrakt geschieht danach hochselektiv mittels Immunoaffinitätschromatografie. Einfach und kostengünstig als offline-SPE mit Einmalkartuschen durchgeführt (z. B. AflaCLEANTM, LCTech GmbH, Dorfen [2]), ist das Verfahren bereits für Labore mit kleinem bis mittlerem Probenaufkommen rentabel. Doch auch SPE lässt sich vollständig automatisieren, indem in der Online-SPE-Variante einem HPLC-System einezweite Pumpe hinzugefügt wird, die eine geeignete Online-SPE-Säule (z. B. VentureTM AF, Mandel Scientific Company, Inc., Ontario, CA) mit der Probe belädt und wäscht [3, 4]. Ein 6-Port-2-Positionsventil erlaubt das Einbinden der Online-SPE in den Strom der HPLC-Analytik, womit die angereicherten Analyten von der SPE-Phase auf die LCSäule transferiert und getrennt werden. Auch hier steigen Reproduzierbarkeit und Probendurchsatz dank Automatisierung deutlich, während mit höheren Probenzahlen auch die Kosten für Verbrauchsmaterialien im Vergleich zur Offlinevariante sinken. Dank der einzigartigen Dual-Gradientenpumpe der Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLC-Plattform, die zwei unabhängige ternäre Gradientenpumpen in einem Gehäuse bereitstellt, und dem maßgeschneiderten Online-SPE-UHPLC+-Solution- Kit von Thermo Scientific, das neben allen benötigten Kapillaren – basierend auf der einzigartigen Viper- Technologie – auch Softwareunterstützung enthält, wird das Aufsetzen einer solchen Online-SPE-Installation zum Kinderspiel.

Detektion im Spurenbereich

Neben einer möglichst effektiven Analytaufreinigung und -anreicherung kommt der Detektion eine maßgebliche Rolle bei der Spurenanalytik zu. Fluoreszenzdetektion ist hier das Mittel der Wahl, ist sie doch selektiv und zudem bis zu 1000-fach empfindlicher als UV-Detektion. Leistungsfähige Fluoreszenzdetektoren wie der Thermo Scientific Dionex UltiMate FLD-3000 sind in ihrem Design ganz auf die Bedürfnisse schneller Chromatografie und auf niedrige Nachweisgrenzen zugeschnitten. Allerdings kommt auch ein Dionex FLD-3000 nicht an den spektroskopischen Eigenschaften der Analyten vorbei und hier zeigt sich bei den Aflatoxinen ein uneinheitliches Bild. Die Fluoreszenz-Emission der Aflatoxine B1 und G1 fällt deutlich geringer aus als die von B2 und G2. Um die geforderten Empfindlichkeiten deutlich zu überbieten, behilft man sich mit einem chemischen Trick – einer Derivatisierung. Neben der Halogenierung mit Brom oder Iod gibt es eine elegante Variante, die auf die Zuführung von Reagenzien verzichten kann: Die „schwächelnden“ Toxine B1 und G1 lassen sich unter UV-Strahlung mit Wasser in die entsprechenden Hydroxyderivate überführen, die deutlich bessere Responsefaktoren aufweisen (Abb. 1 b). Diese Fotokon version lässt sich in einer Nachsäulenderivatisierung schnell und einfach umsetzen. Ein geeigneter UV-Reaktor wie das UV-Derivati sierungsmodul UVE von LCTech GmbH wird zwischen Trennsäule und Detek tor eingesetzt und nutzt das in der mobilen Phase enthaltene Wasser als Derivatisierungsreagenz. Wie Abbildung 3 a zeigt, wird so das Signal-Rauschen-Verhältnis für alle vier Aflatoxine deutlich verbessert – für die nativ schwach fluoreszierenden B1 und G1 um den Faktor 30 und selbst für B2 und G2 noch um den Faktor 1,5. Die anspruchsvolle Bestimmungsgrenze von 0,1 ng /ml in Babynahrung wird problemlos unterschritten (Abb. 3 b).

Fazit

Die Analytik von Aflatoxinen stellt nach wie vor eine Herausforderung für die Analytik dar. Ist die chromatografische Trennung selbst auch nicht allzu fordernd, so stellt die niedrige, vom Gesetzgeber geforderte Bestimmungsgrenze hohe Ansprüche an Probenvorbereitung und Detektion. Automatisierung und Nachsäulenderivatisierung ermöglichen es, in Verbindung mit modernster Detektortechnologie die hohen Standards der Qualitätssicherung einzuhalten.

Referenzen

[1] http://www.griffith.ox.ac.uk/gri/4sea1no2.html
[2] http://www.lctech.de/Mykotoxine
[3] http://www.laborundmore.de/archive/181,508580/Chromchat/Isohumulone-in-Bier.html
[4] http://www.dionex.com/en-us/webdocs/67572-LPN-2069-01-Aflatoxins-note.pdf

Foto: © Dr. Markus Martin