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Vom Dessert zur ­Geweberegeneration

Entwicklung der nächsten Generation synthetischer extrazellulärer Matrizen für die 3D-Zellkultur

In japanischen Restaurants serviert der Kellner zum Nachtisch stets kunstvoll dekorierte Desserts. Sie sind buntgefärbt und köstlich. So manchen werden sie an den Pudding erinnern, den man aus der westlichen Küche kennt. Diese fernöstlichen Süßspeisen werden aus Agarose zubereitet. Das Zuckerpolymer oder Polysaccharid aus Rotalgen findet seit über 400 Jahren Verwendung in der Küche. Erst seit Kurzem hat Agarose Eingang in die deutschen Küchen gefunden – unter anderem als vegetarischer Ersatz für Gelatine in Torten.

Statt die Auslagen deutscher Konditoreien zu durchstöbern, reicht es, wenn man auf der ­Suche nach dem Geliermittel in ein beliebiges Biologielabor läuft: Irgendwo zwischen den gängigen Laborutensilien findet sich eine ­Flasche Agarose, bereit, in Wasser aufgelöst zu Gelen gegossen zu werden – tagtäglich setzen es Forscherinnen und Forscher in einer Vielfalt biologischer Analysemethoden ein. Für den ­Biologen ist Agarose im Labor unersetzlich geworden, um DNA und Proteine aufzureinigen. Die Polysaccharide bilden ein Hydrogel, ein Poly­mer, das Wasser einschließt. Dank dieser Eigenschaft ist es mit Agarose möglich, die Umgebung, die im menschlichen Gewebe herrscht, nachzubilden: ein ideales Werkzeug für die rege­nerative Medizin. In diesem aufstrebenden Forschungszweig versuchen Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler, Gewebe und Organe nach­zubauen, um ihre normale Funktionsfähigkeit wieder herzustellen [1]. Da die mechanischen Eigenschaften der Agarose das natürliche Umfeld von Chondrocyten (Knorpelzellen) nachempfinden, wurde das Gel erst nur dazu mitgenutzt, Knorpelgewebe herzustellen. Kürzlich gelang es einem Team in unserem Labor an der Universität Freiburg, den Anwendungsbereich von Agarose zu erweitern: Es gelang, eine Agarose mit der ganzen Palette von mechanischen Eigenschaften, die man in Säugetiergewebe finden kann, zu entwickeln. Dieses anpassungsfähige Gel eröffnet neue Perspektiven für die Nachbildung von mensch­lichen Geweben im Labor [2].

Zellkultur in 2D stößt an Grenzen

Zellkulturen wachsen normalerweise auf mit Gammastrahlen behandeltem Polystyren, ein Plastikpolymer, auch Plastikzellkulturmaterial oder „tissue culture plastic“ (TCP) genannt. Dank der Eigenschaften des Materials kann die Oberfläche mit Proteinen beladen werden. Zellen binden an diese Proteinschicht, verbreiten und vermehren sich. Diese Technik wird seit vielen Jahren weltweit in Zellbiologielaboren verwendet, da sie sowohl einfach zu nutzen als auch günstig ist. Das Produkt ist anwenderfreundlich. Bedauerlicherweise ähnelt diese Petrischalentechnik nur wenig dem Umfeld, dem Säugetierzellen im Gewebe ausgesetzt sind: Während Zellen in der Plastikgewebekultur 2D-Einzelzellschichten bilden, nutzen sie im Gewebe ein 3D-Gerüst, die extrazelluläre Matrix (ECM) (Abb. 1).



Abb.1 Die Zellen (grün) binden in ihrer natürlichen Umgebung durch spezifische Marker (pink) an ein mechanisches Stütznetz aus Polysacchariden (gelb) und Faser­proteinen (blau). Gelöste Proteine wie Wachstumsfaktoren (lila) ermöglichen die Kommunikation zwischen Zellen und matrixabbauenden Enzymen (schwarz) und modellieren die Matrix um.

Die Matrix besteht aus verschiedenen Komponenten wie Polysacchariden und Makroproteinen. Sie versorgt die Zellen mit Nährstoffen, präsentiert Signalproteine zur Kommunikation zwischen den Zellen und dient als mechanische Stütze. In 2D-Systemen versorgt das Medium die Zellen zwar mit Nährstoffen und Proteinen wie in einem Gewebe, die mechanische Unterstützung unterscheidet sich jedoch stark von der im natürlichen Umfeld. Auf 2D-Systemen organi­sieren sich Zellen ganz anders als in vivo: Auf TCP, der Plastikgewebekultur, nehmen Endothelzellen, die das Innere von Blutgefäßen auskleiden, eine längliche Form an und wachsen einzeln (Abb. 2 A). In der natürlichen Um­gebung, z.B. in der Niere, kollaborieren die ­Zellen, um Blutgefäße aufzubauen (Abb. 2 D). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die genetische Informationsverarbeitung von Zellen aus der 2D-Kultur mit der von natürlich wachsenden Zellen des gleichen Typus nicht übereinstimmt [3,4].



Abb.2 Das Substrat, auf dem Zellen wachsen, beeinflusst ihre Form und Organisation. Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von menschlichen Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVEC) auf verschiedenen Substraten. Der Kern ist blau, die Actinfilamente sind grün gefärbt. A: Auf einer 2D-Plastik­gewebekultur wachsen die Zellen einzeln und haben eine flache Form. B: Auf Matrigel®, einer tierischen extrazellulären Matrix (ECM), organisieren sich Zellen zu einem Netz von Kapillaren. C: Auf der synthetischen ECM der nächsten Generation bilden die Zellen mehrzellige blutgefäßähnliche Strukturen. D: Blutgefäße einer Mausniere; die Zellkerne sind blau und das CAV1-Pro­tein, spezifisch für Endothelzellen, ist grün angefärbt. Balken, 10m.

Das Paradigma der Gewebekonstruktion

Um den Unterschied zwischen In-vivo- und In-vitro-Versuchen zu verringern, ist eine angestrebte Lösung, das natürliche dreidimensionale Umfeld, das unterschiedliche Organe aufweisen, nachzubauen. Steinberg entwickelte als einer der Ersten in den frühen 1960er-Jahren diesen Ansatz, der in den 1980er-Jahren mit den Arbeiten von Langer und Vacanti [6] als das „Tissue-Engineering“-Paradigma bekanntwurde (s. Kommentar). Demnach muss ein synthetisches ­Gewebe, um die Umgebung von Zellen nach­-zu­empfinden (1.) lösliche Signale vermitteln, (2.) Zellen mechanisch stützen (3.) und dazu spezifische und genau zugewiesene Haftungsmotive zur mechanischen Stütze der Zellen beinhalten, (4.) Zellen die Möglichkeit bieten, das Substrat abzubauen und so das Gewebe umzumodellieren [7] (Abb. 3). Um diese Zieleigenschaften zu erreichen, wurden einige Alternativsysteme zum 2D-Plastikkulturmodell entwickelt.



Abb.3 Das „Tissue-Engineering“-Paradigma. Synthetische extrazelluläre Matrix (ECM) muss die essenziellen Eigenschaften von Geweben ­kopieren; d.h. sie muss mechanische Unterstützung bieten, an der Zellen binden können, muss gelöste Signalstoffe an die Zelle übermitteln, und sie muss sich mit Zellenzymen abbauen und ­modellieren lassen. (Aurelien Forget Doctoral Dissertation (2013).

Gewebemechanik als biologisches Signal

Die Entwicklung von 3D-Substraten begleiteten Fortschritte im Verständnis der Biologie der Matrix, die es ermöglichten, Aminosäuresequenzen zu identifizieren, an denen sich Zellen in der Matrix verankern. Die Topografie der Matrix ­beeinflusst die Form und das Überleben der Zellen. Diese Erkenntnisse zeigten: Die Matrix trägt biologische Signale [8]. Somit ist es wichtig, dass Projekte, die versuchen, biologische Sig­nale in und zwischen Zellen zu verstehen (wie etwa in den Forschungsprojekten am Exzellenzcluster BIOSS Centre for Biological Signalling Studies der Universität ­Freiburg), die physikalischen Signale berücksichtigen. Dementsprechend untersucht unsere Gruppe am Institut für Makromolekulare Chemie die Interaktion von Zellen mit ihrer Umgebung. Unter anderem untersuchen wir, wie physikalische Informationen, die Topografie der Oberfläche oder die Steifheit des Substrats die Organisation und die Funktion der Zellen beeinflussen. Mit diesem Wissen könnten vielleicht in Zukunft voll-funktionsfähige Gewebe im Labor nachgebaut werden.

Herausforderungen bei der Entwicklung einer synthetischen extrazellulären Matrix (synECM)

Die 3D-Zellkultursysteme, die bis heute entwickelt wurden, haben einige Nachteile: Der Preis ist hoch, jedes Zellsystem braucht ein speziell angefertigtes Material, der Aufbau und die Handhabung sind aufwändig und die Materialen können oft nicht in der Klinik angewendet werden, da man für ihre Entwicklung auf komplexe Chemie oder Stoffe aus Tieren zurückgreifen muss. ­Diese Probleme machen es schwer, für die ­3D-Stützsysteme sich im Laboralltag gegen das 2D-TCP durchzusetzen. Ihre Anwendung beschränkte sich demnach auf spezialisierte ­Labore mit dem nötigen „Knowhow“ in Materialforschung und Zellbiologie. Um mit dem verbraucherfreundlichen 2D-TCP-Modell konkurrieren zu können, müssen Systeme entwickelt werden, die jeder Biologe ohne Vorkenntnisse der Materialwissenschaften verwenden kann. Um diesem Anspruch gerecht zu werden, haben wir eine neue Generation synthetischer extrazellulärer Matrizes (synECM) entwickelt, die die Grenzen der bisherigen 3D-Modelle überwindet. Sie ist günstig (1), leicht in die Klinik übertragbar (2), vielseitig (3) und einfach anzuwenden (4) (Abb. 4).



Abb.4 Charakteristika zur Entwicklung der nächsten Generation synthetischer extrazellulärer Matrizes

Eine neue Generation der synECM

(1) Als Ausgangsmaterial nutzten wir ein in der Natur reichlich vorhandenes Zuckerpolymer, das auch in japanischen Nachtischen vorkommt. Agarose ist nicht nur essbar, es ist ein inertes und bioverträgliches Material, das schon seinen festen Platz im Labor einnimmt – mit einer ­langen Geschichte von In-vitro- und In-vivo-Anwendungen. Da Agarose selbst keine biologische Information an Zellen vermittelt, reagieren Zellen in der synECM ausschließlich auf vom Nutzer im Agaroserückgrat eingeführte biologische Signale. Diese können löslich oder an der Matrix be­festigt sein. Somit hat die Agarosematrix ein sehr niedriges biologisches Rauschen (2). Durch chemische Modifikation der Agarose entstehen physikalische Hydrogele, die bei Raumtemperatur fest werden und sich innerhalb des Körpers verwenden lassen. Somit hat Agarose großes Potenzial, in der Klinik Anwendung zu finden, da es als Lösung injiziert werden kann und ohne Zusatz weiterer Chemikalien sofort zum Gel wird (3). Bisherige synECM-Systeme bauen eine spezifische Gewebeumgebung nach. Wir haben die Agarose so modifiziert, dass die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels an eine Vielzahl von Geweben angepasst werden können, z.B. Hirn- oder Knorpelgewebe. Diese einzigartige Vielseitigkeit machte es möglich, das neue System als Grundlage für das Wachstum einer ganzen Reihe von Zellentypen zu verwenden (4). Schließlich haben wir die modifizierte Agarose grundlegend charakterisiert und können reproduzierbar ein Material herstellen, das präzise mechanische Eigenschaften und Zellpep­tide präsentieren kann. Die agarosebasierte synthetische Matrix kopiert die Zusammensetzung natürlicher Gewebe. Auf diese Weise stellt das Gel eine einzigartige Umgebung dar, in der sich Endothelzellen in vitro organisieren (Abb. 2C). Dieser Vorgang ähnelt stark dem Wachstum von Blutgefäßen in vivo (Abb. 2D). Dies konnte weder in der 2D-Plastikzellkultur noch im Matrigel®, einer geläufigen, aus tierischem Material gewonnen ­Matrix, beobachtet werden (Abb. 2B).

Die Zukunft der synthetischen ­extrazellulären Matrix

SynECMs werden in Zukunft eine wichtige Rolle spielen – in vielen Bereichen der Wachstumsbranche Biotechnologie. Sie sind nicht nur eine zuverlässige Alternative zu tierischen Produkten wie von Zellen befreites tierisches Gewebe, son­dern synECMs könnten helfen, automatisierte High-throughput-Screens zu entwickeln, die auf Gewebekultur basieren. Durch diese Art von organkulturbasierten Screens könnte eine schnellere Wirkstoffforschung ermöglicht werden. Es würde nicht nur die Dauer bis zum Übergang vom Labor in die Phase I der klinischen Tests verringert, ebenso könnte auch die Anzahl der Tierversuche reduziert werden. Für die High-troughput-Anwendung sind die Kosten und die einfache Manipulation des Produkts wesentlich. Die Möglichkeit, sowohl physikalische als auch biologische Mikroumgebungen auf Zellen einzustellen, kann helfen, die Entwicklung von Krankheiten zu verstehen und neue Ansätze zur Diagnose und Behandlung zu entdecken. Die neuen synthetischen, extrazellulären Matrizes erweitern das typische 2D-Screening-System um eine lang gesuchte dritte Dimension. Die „One-pot“-Synthese unserer synECMs, bei der alle Reaktionen in einem Gefäß unter physiologischen Bedingungen stattfinden, macht den Übergang von 2D zu 3D leichter. Unsere Agarosematrix ist der erste Schritt zu einem 3D-Stützsystem, in dem die physikalischen Eigenschaften und biologisch aktiven Motive durch einfaches Mischen der unterschiedlichen Komponenten zusammenfügt werden können. Dazu nutzen wir neue ­Erkenntnisse über die Interaktion von Peptiden und Proteinen. Mit der Unterstützung des Exzellenzclusters BIOSS Centre for Biological Signalling Studies erzeugten wir ein natürlich vor­kommendes Zuckerpolymer mit veränderbaren phy­siochemischen Eigenschaften. Wir hoffen, dank dieser Entdeckung den Übergang der Zellkultur von 2D nach 3D zu beschleunigen. Beim nächsten Besuch eines japanischen Restaurants vergessen Sie also nicht das Dessert. Wer weiß, ob es Ihnen nicht einmal das Leben rettet.

Literatur
[1] Mason, C. & Dunnill, P. (2008) Regen. Med., 3, 1–5
[2] Forget, A. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., i, 1–6
[3] Katz, E. et al. (2011) PLoS One, 6, e17083
[4] Kenny, P. a et al. (2007) Mol. Oncol., 1, 84–96
[5] Steinberg, M. (1963) Science, 141, 401–408
[6] Langer, R. & Vacanti, J. P. (1993) Science, 260, 920–6
[7] Shastri, V. P. (2012) Drug Deliv. Transl. Res., 2, 293–296
[8] Lipski, A. M. et al. (2008), Biomaterials, 29, 3836–46

Foto © panthermedia.net| Hiroshi Tanaka

Stichwörter:
tissue engineering, Zellkultur 2D fernöstlichen Süßspeisen, Agarose, Gelatineersatz

L&M 2 / 2014

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 2 / 2014.
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