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UHPLC - Polare Phasen - Peptidtrennung

Innovative Lösungen für die hohen Anforderungen der modernen HPLC-Analyse

CS-Chromatographie Service zeigt, wie Analysen auf höchstem Stand ermöglicht werden.

Die Entwicklung der HPLC ist durch ein Schlagwort geprägt: „UHPLC“. Die ultraschnelle LC mit dem Trend zu kleineren Partikeldurchmessern ermöglicht höhere Auflösungen, kürzere Trennsäulen und dadurch schnellere Analyen. Selektivität ist in der Chromatographie immer ein Thema von Bedeutung. Polare stationäre Phasen, die in unterschiedlichen Trennmodi eingesetzt werden können, sind hilfreiche Werkzeuge für die Methodenentwicklung. Die Analyse von Biomolekülen hat in der Vergangenheit stark zugenommen. Die Bedürfnisse für die HPLC von beispielsweise Peptiden und Proteinen sollten bereits bei der Phasenauswahl berücksichtig werden. Schnelligkeit mit UHPLC

UHPLC, U-HPLC, UPLC®, X-LC®, RRLC®,UFLC®, Fast LC ... Hinter all diesen Begriffen „versteckt“ sich die schnelle HPLC, welche erst durch Entwicklungen der Gerätehersteller möglich gemacht wurde. Mindestens so wichtig wie die instrumentellen Voraussetzungen der Geräte sind geeignete Säulen mit kleinen Partikeln (1,5 µm–2,5 µm). Je kleiner die Partikel, desto größer die zu erwartende Trenneffizienz. Gleichzeitig steigt aber auch der Druck, was zu Einschränkungen führt. Die MultoHigh®-U-Säulen enthalten 2- µm-Partikel mit sehr enger Größenverteilung und bieten ein optimales Verhältnis zwischen Trenneffizienz und Gegendruck. So können Anwender mit Standard-HPLC-Systemen, die z.B. bis 400 bar ausgelegt sind, bereits mit hohen Flussraten die Vorteile der schnellen HPLC nutzen. Gleichzeitig können auf UHPLC-Systemen (Drücke bis 1000 bar) optimale Trennleistungen auch bei maximalem Fluss erreicht werden.

Vorteile

>> Auflösung – bei gleicher Säulenlänge größere Trenneffizienz im Vergleich zu Säulen mit beispielsweise 5-µm-Partikeln.

>> Geschwindigkeit – deutliche Verkürzung der Analysezeit. Selektivität durch Polarität Polare Phasen, wie die polaren Multo-Phasen, lassen sich sowohl für die Normalphasen-Chromatographie (z.B. mit Hexan-Isopropanol-Gemischen), als auch für die Umkehrphasen- Chromatographie (z.B. mit Acetonitril-Wasser- Gemischen) einsetzen. Das Ändern des chromatographischen Retentionsmodus, z.B. von Normalphase auf Umkehrphase bedeutet aufwändiges Spülen und kann die Packungsstabilität beeinträchtigen. Daher werden spezielle RP- bzw. HILIC-Säulen angeboten. Diese werden im RP-Modus getestet und kommen während des gesamten Herstellungsprozesses nur mit ausgewählten und geeigneten Lösungsmitteln in Kontakt.

Insgesamt werden vier Polare „Multo“-Phasen angeboten:

>> MultoHigh® Phenyl ist eine polare RP-Phase, die eine hervorragende Ergänzung zu alkylmodifizierten Phasen darstellt.

>> Multospher®-APS-HP ist die neue, vielseitige Amino-(NH2)-HPLC-Phase.

>>MultoHigh® Cyano ist eine Cyanopropylphase, welche für den Normalphasen- und den Umkehrphasenmodus geeignet ist.

>> MultoHigh® DIOL bietet eine Alternative zu reinen Silicaphasen.

Stabilität bei Biophasen

Zur Trennung von Polypeptiden und anderen Biomolekülen werden meist Trennphasen auf Basis von Kieselgel eingesetzt, bei denen durch Bindung von linearen Kohlenwasserstoffketten eine hydrophobe Oberfläche erzeugt wird. Zum Einsatz kommen überwiegend C4-, C8- und C18-Ketten, wobei die Länge der C-Ketten nur eine untergeordnete Rolle in Bezug auf die Effektivität von Proteintrennungen hat. Da der weitaus größte Teil der interaktiven Oberfläche innerhalb der Poren der Kieselgelmatrix liegt, spielt die Porengröße insbesondere bei der Trennung von Biopolymeren eine bedeutende Rolle. Eine Porengröße von 100 Å, wie sie in der HPLC häufig verwendet wird, lässt sich ohne Nachteile nur für kleine Moleküle einsetzen. Für größere Moleküle sind entsprechend größere Porendurchmesser notwendig (200 Å bzw. 300 Å). Mit der MultoHigh®-BIO-Serie werden jetzt HPLCPhasen geboten, optimiert für die Analytik von Biomolekülen. Durch eine verbesserte Bindungstechnologie wird eine höhere pH-Stabilität erreicht, welche wiederum häufigeres Spülen mit stark sauren oder basischen Eluenten erlaubt. Außerdem sind Phasen mit 200-Å-Porengröße verfügbar, die speziell für den Peptid- und Polypeptidbereich angepasst sind.

>> www.cs-chromatographie.de

Stichwörter:
Analytik, Chromatographie, UHPLC, Peptide, polare Phase

L&M 5 / 2009

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 5 / 2009.
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© Text und Bild: Altmann Analytik

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