Peptidreinigung - Eine Methode zum Vergleich von chromatografischen Sorbentien

Silikagel

von Dr. Nicola Forrer

Dr. Nicola Forrer*, David Gétaz**, Mumun Gençoglu** und Prof. Dr. Massimo Morbidelli**

* Zeochem AG,
** ETH Zürich, Institut für Chemie and Angewandte Biowissenschaften

Um das am besten geeignete Silikagel für eine bestimmte Trennung zu finden, muss ein Vergleich zwischen verschiedenen Kieselgelen durchgeführt werden. In der Validierung werden alle Materialien zumeist unter identischen Prozessbedingungen (mobile Phase Zusammensetzung, Gradient etc.) geprüft und miteinander verglichen.

Unter diesen Bedingungen zeigen oft ähnliche Materialien (d.h. gleiche Derivatisierung, gleiche Poren- und Partikelgrösse) sehr unterschiedliche Leistung. Gleiche Prozessbedingungen ergeben typischerweise unterschiedliche Adsorptionsstärken auf den verschiedenen Silikagelen. Also ist die Retentionszeit der Analyten auf der Säule unterschiedlich. Die Säule, in der die Verweilzeit am längsten ist, wird bessere Chancen für eine gute Trennung haben, weil die Moleküle mehr Zeit haben, sich voneinander zu trennen (wenn die Rückdiffusion nicht zu groß wird). Einen besseren Vergleich kann man erreichen, wenn man dafür sorgt, dass die Retentionszeiten auf allen Säulen gleich sind. Eine Methode, die einen solchen Vergleich ermöglicht, wird hier vorgestellt. Bei Large Scale-Anwendungen ist die Leistung von einem chromatografischen Material unter überladenen Bedingungen wichtig. Diese Leistung wird normalerweise als „Ausbeute bei einer bestimmten Reinheit“ bestimmt. Die Ausbeute kann auch als Funktion der Reinheit aufgetragen werden. So entsteht eine so genannte Pareto-Kurve. Das heißt, dass, wenn einer der beiden Parameter groß ist, dann muss der andere klein sein und umgekehrt. In der Praxis bedeutet dies, dass man entweder mit hoher Reinheit und geringer Ausbeute chromatografieren kann oder umgekehrt („magisches Dreieck“).

Experimenteller Teil

Die Güte der Reinigung eines kommerziellen Peptids wurde auf drei Silikagelen, ZEOsphere 100 C18 15 µm und zwei analogen (d.h. gleiche Derivatisierung, gleiche Porenund Partikelgrösse) Materialien untersucht. Es galten die gleichen Prozessbedingungen bei den drei Materialien und es wurde ein reines Peptid eingesetzt. Alle Versuche wurden auf einer Agilent 1100 Series HPLCAnlage durchgeführt.

Wie man in Abb. 1 sehen kann, werden auf den drei Materialien stark unterschiedliche Retentionszeiten für das Peptid erhalten. Ein Vergleich unter diesen Bedingungen wäre nicht gerecht, weil die Analyten auf dem Silikagel 2 Material längere Zeit für die Trennung zu Verfügung haben. Um die Trennleistung verschiedener Materialien besser vergleichen zu können, müssten die Retentionszeiten aller Komponenten auf allen Materialien gleich sein. Da dies praktisch unmöglich ist, muss eine Schlüsselkomponente ausgewählt werden, das reine Peptid. Ziel der Methode ist, die Retentionszeit des reinen Peptids auf allen Materialien zu normieren und gleich zu halten. Dies wird dadurch erreicht, indem die Prozessbedingungen (Gradienten-Steigung) für jedes Säulenmaterial so angepasst werden, dass die Adsorptionskraft als Funktion der Zeit für das reine Peptid gleich ist.

Abb. 1 Das reine Peptid wurde auf drei Trennsäulen (250 x 4.6 mm) injiziert. Die Säulen wurden mit ZEOsphere 100 C18 15 µm und mit zwei analogen Silikagel-Materialien gefüllt. Der gleiche Gradient (3.83 g/L/min Acetonitril) wurde für alle drei Säulen benutzt. Die Flussrate betrug 1 mL/min. Die mobile Phase bestand aus einer Acetonitril/ 120 mM H3PO4/NaH2PO4 (pH 2.2) Mischung.

Die Trennung der rohen Peptidmischung wurde mit den angepassten Gradienten auf den 3 stationären Phasen untersucht. Wie in Abb. 2 zu erkennen ist, zeigen jetzt die drei Säulen die gleiche Retentionszeit für die Hauptkomponente und ungefähr auch die gleiche Trennleistung.

Die Trennleistung wurde auch unter überladene Bedingungen bestimmt. Die angepassten Gradienten wurden benutzt. Die Pareto-Kurven für die drei Materialien sind in Abb. 3 gezeigt.

Die untersuchten Säulenmaterialien zeigen eine ähnliche Performance, wenn die Gradienten mit der zuvor beschriebenen Methode normiert werden. ZEOsphere 100 C18 15 µm zeigt ein wenig höhere Leistung als die zwei anderen Silikagele. Die gleiche Methode wurde für eine zweite Trennung angewendet. Hier wird ein Polypeptid auf ZEOsphere 100 C18 10 µm und auf einem äquivalenten Kieselgel untersucht. Eine analoge Gradient-Anpassung wie im vorherigen Beispiel wurde auch für das Polypeptid durchgeführt. Auch in diesem Fall wurde eine rohe Mischung benutzt und die Trennleistung unter überladenen Bedingungen untersucht. Die Pareto-Kurven sind in Abb. 4 dargestellt.

Fazit

Eine Methode, die einen besseren Vergleich zwischen ähnlichen (d.h. gleiche Derivatisierung, gleiche Poren- und Partikelgrösse) Säulenmaterialien ermöglicht, wurde beschrieben. Die Sorbentien wurden unter normierten Bedingungen verglichen und die Methode wurde auf zwei Peptid-Reinigungen angewendet. Der Vergleich hat gezeigt, dass, wenn die Prozessbedingungen für jede Säule wie beschrieben angepasst werden, gleichartige Materialien eine ähnliche Trennleistung unter überladenen Bedingungen zeigen.