LC - Spezialphasen für die MS

von Dr. Andrea Junker-Buchheit

Die Liquid Chromatography (LC) hat sich in den vergangen Jahren konstant weiterentwickelt und ist heute mit der massenspektrometrischen Detektion als Analysenverfahren in vielen Bereichen der Gold-Standard. Dies zeigt auch der zunehmende Einsatz der LC/MS/MS in der toxikologisch-forensischen Analytik – als gleichwertige Ergänzung zur etablierten GC/MS/MS.

Die Vorstellung, dass aber auf HPLC-Säulen bestimmter Selektivität künftig gänzlich verzichtet werden kann, hat sich jedoch als nicht richtig erwiesen. Dieser Anspruch mag zwar korrekt sein für die Analytik einer geringen Anzahl von Verbindungen, tritt aber bei einer Multikomponenten- oder Metabolitenanalyse oder einer komplizierten Matrix, wie z.B. Lebensmittel, nicht länger zu. Eine „besondere Selektivität” ist meistens nötig bei der Trennung von Analyten und Matrix (Ionensuppression), von Isomerengemischen
und von Verbindungen mit gleicher Molekülmasse. LC-Spezialphasen als Selektivitätstool bieten häufig erhebliche Vorteile, wie beispielsweise Einsatz einfacher mobiler Phasen, Verzicht auf Ionenpaarreagenzien und exotische Puffer, Arbeiten in normalen pH-Bereichen und chromatografische Trennung „kritischer” Analyten. Im Allgemeinen resultieren als messbare Ergebnisse höhere Robustheit und Reproduzierbarkeit und längere Säulenstandzeiten; zudem treten weniger Geräteprobleme auf.
Dies bedeutet, dass in Abhängigkeit von der analytischen Fragestellung sehr wohl Säulen bestimmter Selektivität vorteilhaft einzusetzen sind. Hier ist eine Reihe von Beispielen zu nennen, wobei Retention der Verbindungen und Selektivität auf Dipol-Dipol-, Wasserstoffbrückenbindungs- und/oder π-π-Wechselwirkungen zurückzuführen sind. Zum Einsatz gelangen in der Mehrzahl kurze Säulen mit kleinen Innendurchmessern mit 3 µm Partikelgröße. Basis ist poröses Kieselgel mit Porenweiten zwischen 80 und 200 Å.

Den Anfang machen Phenylphasen, die generell als Alternative zu den alkyl modifizierten C8- und C18- Kieselgelen zu verstehen sind. Sämtliche, in der Tabelle aufgelisteten Phasen unterscheiden sich sowohl in der Kieselgelmatrix und Oberflächenmodifikation als auch in der Art des Spacers, mit dem die Phenylgruppe an die Kieselgelmatrix gebunden ist. Sie variieren demzufolge sowohl in Selektivität als auch pHStabilität. Phenylphasen bieten andere Selektivitäten und sind somit die ideale Ergänzung zu Alkylphasen – zumal sie
sowohl als typische RP-Phasen als auch mit nicht wässrigen Lösemitteln einsetzbar sind. Ihre erweiterte Selektivität zeigt sich vor allem bei Verbindungen mit Pi-elektronenreichen
Strukturen. Zudem sind sie in der Lage, Analyte zu trennen, die Unterschiede in ihrer „Form”
bzw. der Ausdehnung des π-Elektronen-Systems aufweisen („shape selectivity”). Für die Kopplung mit dem Massenspektrometer gilt, dass das Blutungsverhalten so gering wie möglich sein sollte.

Exemplarisch einige namhafte Hersteller

Agilent Technologies Zorbax StableBond-Phenyl
Bischoff ProntoSIL Phenyl
EKA Chemicals/Akzo Nobel Kromasil® HPLC 100 Å PHENYL
Grace GENESIS® Phenyl
Macherey-Nagel Nucleosil Ph 5.0 µm
Phenomenex C6-Phenyl HPLC Phase
Sigma-Aldrich Ascentis® Phenyl HPLC Säulen
ThermoElectron Hypersil® Phenyl, Betasil Phenyl
Varian Pursuit® Diphenyl

Eine zweite Gruppe von HPLC-Packungs materialien, die eine „andere“ Selektivität aufweisen, sind sogenannte polar-embedded Alkylphasen. Im Vergleich zu herkömmlichen
RP-Phasen werden die unerwünschten Wechselwirkungen an der Kieselgeloberfläche – in der Regel Restsilanole – durch ein bestimmtes Bonding minimiert, das zu einer Abschirmung der aktiven Kieselgeloberfläche führt. Zu den Polar Embedded Groups (PEG) zählen u.a. Carbamat-, Harnstoff-, Ether- und Amidbindungen, die neben der Abschirmung zusätzlich noch für Wechselwirkungen mit polaren Molekülen sorgen. Es resultieren
oftmals atypische Selektivitäten bei gleichzeitig verbesserter Peaksymmetrie bei polaren Analyten, und selbst der Einsatz von 100 % rein wässrigen Eluenten ist ohne Phasenkollaps möglich.

Auch hier gibt es eine Reihe von Herstellern (z.B. Waters (Symmetry Shield RP 8/18, Xterra RP 8/18), Varian (Polaris C8/C18, C8/18 Ether, C8/18 Amide), Sigma-Aldrich
(Ascentis RP-Amide-Phase), Bischoff (ProntoSIL C18- EPS ), ThermoElectron (Hypersil HyPURITY Advance), Agilent Technologies (Zorbax Bonus-RP), wobei insbesondere
C18- oder C8-Ether-Phasen herausgegriffen werden sollen, weil sie über freie Elektronenpaare an der Ethergruppe für Wechselwirkungen mit Säuren sorgen. Allgemein
zeigen polar-embedded RP-Phasen Selektivitäten für Säuren, Phenole und ausgewählte N- und S-haltige Verbindungen. Hierfür werden vor allem Wasserstoffbrückenbindungs-
Wechselwirkungen verantwortlich gemacht.

Eine letzte Klasse von Phasen, die MS-tauglich sind und besondere Selektivitäten gegenüber Basen und Verbindungen mit Elektronenpaardonator-Eigenschaften aufweisen, sind die perfluorierten Packungsmaterialien. Insbesondere seien hier die Pentafluorphenylphasen erwähnt (z.B. Monochrom MS, Allure PFP Propyl, Discovery
F5 HS, Pursuit PFP). Hierbei sind Pentafluorphenylgruppen über Alkylspacer an die Kieselgelmatrix gebunden. Durch den starken Elektronenzug der Fluoratome
weist deren Pi-Elektronensystem einen starken Elektronenmangel auf. Unter RP-Bedingungen wird auf diesen Phasen eine starke Retention von Basen und elektronenreichen Verbindungen beobachtet, wozu verschiedene Wechselwirkungen beitragen:

Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und
π-Wechselwirkungen. Interessanterweise scheint es bei der Retention von Basen auf den
Organik-Gehalt der mobilen Phase anzukommen:
Mobile Phasen mit einem hohen Anteil von Organik und geringen Pufferkonzentrationen sind notwendig, um Basen zu retenieren, was einem HILIC-Mechanismus entspricht. Zudem führt der hohe Anteil von organischem Modifier dazu, dass eine hohe Empfindlichkeit
bei der ESI/MS erreicht wird.

Apropos HILIC

HILIC steht für Hydrophile Interaktionschromatographie und stellt eine Alternative dar, hoch polare Verbindungen wie Aminosäuren, Peptide und Kohlenhydrate zu trennen. Es werden polare stationäre Phasen verwendet, aber mit typischen RP-Puffersystemen, vorzugsweise Acetonitril als organischem Modifier, betrieben. Wasser weist dabei die höchste Elutionskraft auf. Eine der bekanntesten Phasen ist die ZIC-HILIC (SeQuant), die für polare und hydrophile Verbindungen gute Trenneigenschaften aufweist. ZIC®-HILIC ist in seinen Eigenschaften eine zu RP-Phasen orthogonale Phase. Ebenso
vertreibt Waters HILIC Phasen (Atlantis HILIC Silica Columns).

Soll die Festphasen-Extraktion on- oder off-line als weiteres Selektivitätstool eingesetzt werden, so kommen neben den erwähnten Spezialphasen und herkömmlichen Phasen noch Säulenmaterialien dazu, die eine ausreichende pH-Stabilität aufweisen. Besonders
dann, wenn Mixed-Mode-Phasen für die Probenvorbereitung eingesetzt werden und eine direkte online-Kopplung mit der LC/MS durchgeführt wird, fallen saure oder basische Eluate an.

Zum genaueren Verständnis verweisen wir auf die entsprechende
Literatur oder Spezifikationen der Herstellerfirmen.