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Dr. Wolfram Marx
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bioconfident grade: Zytokine & Wachstumsfaktoren
bioconfident grade: Zytokine & Wachstumsfaktoren
Dr. Wolfram Marx und Dr. Mario Mehmel, AppliChem GmbH, Darmstadt Das Expressionssystem 1.) Endosperm der Gerste: Der zelluläre Hintergrund Der Wirtsorganismus Gerste besitzt mit dem Endosperm ein spezialisiertes Speichergewebe, mit einer guten Proteinexpressionsmaschinerie, mit typischer eukaryontischer Proteinfaltung und – da Speichergewebe – für Proteine stabilisierende Umgebungbedingungen für die Langzeitlagerung. Diese biochemische Umgebung kann trefflich als inert bezeichnet werden, denn sie ist endotoxinfrei, besitzt nur eine sehr niedrige Proteaseaktivität und einen niedrigen Gehalt an Sekundärmetaboliten, sowie einem einfachen Proteinprofil. All diese Faktoren erleichtern das „downstream processing“ erheblich. 2.) Die Expressionskassette Die Expressionskassette erlaubt eine hohe, Lokus- und Zeit-spezifische, stabile Expression des klonierten, rekombinanten Genes. Das Konstrukt ist für die Klonierung kleiner und großer Gene im Hochdurchsatzverfahren geeignet. 3.) Die Kultivierungstechnik Durch die Nutzung modernster Züchtungsmethoden wird eine optimale Ertragsrate erreicht. Die Gerste wird hydroponisch, auf vulkanischem Bimsstein kultiviert, auf einem automatisiertem Förderband, welches die sich entwickelnde Gerste durch verschiedene Kultivierungszonen befördert. Jede Kultivierungszone bietet der Pflanze, die für ihre Entwicklung optimale Nährstoff- und Wassermenge. Dies ermöglicht nicht nur eine genaue Kontrolle aller der Pflanze zugeführten Stoffe, sondern erlaubt auch eine Gerstenkulturzucht mit minimalsten Umwelteinflüssen und Randbedingungen auf das biologische System. Im Ergebnis erzielt man eine optimale Expression bei niedrigerer Gesamtkeimzahl und am Ende des Prozesses eine leichtere Validierung.
4.) Genetisch gleichartige (isogenische) Linien für Saatgutbanken Für die Herstellung einer doppelt-haploiden, isogenischen Linie wird eine Gersten-haploid Mikrosporen-Kulturtechnologie eingesetzt. Als Ergebnis erhält man eine Genom- weite Homozygotie, was die Saatgutbank- Validierug erleichtert und die Konformität des Rohmaterials für eine sicherere pharmazeutische Anwendung garantiert. Isogenische Linien sind genetisch identische Linien über das gesamte Genom gesehen. Dies erleichtert die Qualitätskontrolle in einer Pflanzen-basierten Produktion von Bioprodukten. Die Qualitätstestung Um zu demonstrieren, dass die in Pflanzen produzierten Zytokine und Wachstumsfaktoren in ihrer biologischen Aktivität zu den zur Zeit kommerziell erhältlichen Proteinen vergleichbar sind, werden alle bioconfident grade Faktoren der entsprechenden Qualitätstestung unterzogen. In den jeweiligen faktorspezifischen Bioaktivitätstests wie z.B. Zellproliferationsassays schneiden alle Produkte vergleichbar zu den in nicht biologisch- sicheren Expressionssystemen produzierten Faktoren ab – häufig sogar besser! Zudem weisen sie häufig in Zytotoxizitätstests eine bessere Verträglichkeit auf, als Faktoren aus anderen Produktionsverfahren!
frei von human- oder tierinfektiösen Agentien niedrige pyrogene und entzündungsauslösende Aktivität frei von anderen endogenen Säuger- Wachstumsfaktoren vergleichbar in eukaryontischer Glykosylierung vollständige, natürliche Faltung durch eukaryontische Quelle frei von tierischen Produkten Serum-frei Endotoxin-frei Antibiotika-frei Niedrige proteolytische Aktivität Mit diesen Eigenschaften sind die bioconfident grade Wachstumsfaktoren und Zytokine theoretisch für den Einsatz in kosmetischen oder pharmazeutischen Anwendungen und für die Kultivierung von Stammzellen prädestiniert. Generelle Anmerkungen zu den bioconfident grade Zytokinen und Wachstumsfaktoren Lagerung und Rekonstitution Die rekombinanten Faktoren werden lyophilisiert geliefert. Typischerweise werden die Proteine in PBS pH 7,2 gelöst, durch 0,2 ?m Filter sterilfiltriert und lyophilisiert. Um Verluste zu vermeiden, bitte das Produkt vor dem Öffnen kurz abzentrifugieren. In der Regel wird empfohlen, das lyophilisierte Protein in sterilem Wasser in einer Konzentration nicht niedriger als 100 ?g/ml zu rekonstituieren. Für die Langzeitlagerung empfehlen wir die Zugabe eines „carrier“ Proteins (0,1 % humanes oder Rinderserumalbumins; HSA oder BSA). Die lyophilisierten Proteine sind mehrere Wochen bei Umgebungstemperatur stabil, werden aber trotzdem bei -20° C gelagert (Langzeitlagerung). Wenn das Protein rekonstituiert wurde, sollte es entweder sofort eingesetzt werden, oder in Aliquots geeigneter Größe bei -20° C eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. Endotoxin-Gehalt Die bioconfident grade Zytokine und Wachstumsfaktoren weisen in der Regel einen Endotoxin-Gehalt unter 0,005 ng pro µg Produkt (0,05 EU/µg) auf, was durch einen turbidimetrisch-kinetischen Assay ermittelt wird. MAT Assay Zusätzlich zu der oben erwähnten Endotoxin- Bestimmung, wird mit den gereinigten bioconfident grade Zytokinen und Wachstumsfaktoren ein Monozyten-Aktivierung- Test (MAT) durchgeführt. Er dient dem Nachweis pyrogener oder entzündungsauslösender Kontaminationen. Es wird hierfür der humane 10-plex Zytokin-Assay eingesetzt, der die IL-6, TNF-α ?und IL-1β ?Induktion bestimmt. Protease-Aktivität Die bioconfident grade Zytokine und Wachstumsfaktoren werden im Endosperm- Gewebe des Gerstenkorns (Hordeum vulgare) exprimiert. Dieses besitzt bis zu 50-mal weniger Protease-Aktivität als E. coli oder Säugerzellen. |
L&M 4 / 2010Das komplette Heft zum kostenlosen Download finden Sie hier: zum Download Die Autoren:Weitere Artikel online lesenNewsSchnell und einfach die passende Trennsäule findenMit dem HPLC-Säulenkonfigurator unter www.analytics-shop.com können Sie stets die passende Säule für jedes Trennproblem finden. Dank innovativer Filtermöglichkeiten können Sie in Sekundenschnelle nach gewünschtem Durchmesser, Länge, Porengröße, Säulenbezeichnung u.v.m. selektieren. So erhalten Sie aus über 70.000 verschiedenen HPLC-Säulen das passende Ergebnis für Ihre Anwendung und können zwischen allen gängigen Herstellern wie Agilent, Waters, ThermoScientific, Merck, Sigma-Aldrich, Chiral, Macherey-Nagel u.v.a. wählen. Ergänzend stehen Ihnen die HPLC-Experten von Altmann Analytik beratend zur Seite – testen Sie jetzt den kostenlosen HPLC-Säulenkonfigurator!© Text und Bild: Altmann Analytik ZEISS stellt neue Stereomikroskope vorAufnahme, Dokumentation und Teilen von Ergebnissen mit ZEISS Stemi 305 und ZEISS Stemi 508ZEISS stellt zwei neue kompakte Greenough-Stereomikroskope für Ausbildung, Laborroutine und industrielle Inspektion vor: ZEISS Stemi 305 und ZEISS Stemi 508. Anwender sehen ihre Proben farbig, dreidimensional, kontrastreich sowie frei von Verzerrungen oder Farbsäumen. © Text und Bild: Carl Zeiss Microscopy GmbH |