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Was man bei der SEC-Analyse von Proteinen beachten sollte

Was man bei der SEC-Analyse von Proteinen beachten sollte

Weniger ist mehr!

Analytische Größenauschlusschromatografie (Size Exclusion Chromatography, SEC) ist die Methode der Wahl, wenn Moleküle anhand ihrer Größe getrennt oder charakterisiert werden sollen. Die Technik nutzt (U)HPLC-Säulen, die mit hochporösen Partikeln gepackt sind. Abhängig von der Größe des Moleküls kann dieses vollständig, teilweise oder gar nicht in die Poren eindringen und durchläuft einen entsprechend längeren oder kürzeren Weg. Größere Moleküle eluieren zuerst, die kleinsten Moleküle zuletzt.

Die Größe der einzelnen Moleküle kann durch Vergleich mit einer Messung bekannter Standards bestimmt werden. Aus den Molmassen der Standards und der jeweiligen Retentionszeit wird eine Kalibrierkurve für die benutzte Säule erstellt, mit der dann die Molmassen unbekannter Proben bestimmt werden können. Abbildung 1 zeigt die Kalibrierkurven für eine Serie von SEC-Säulen, die speziell für die Antikörperanalytik entwickelt wurden, im Vergleich zur TSKgel G3000SWXL-Säule, die als Goldstandard für ­diese Anwendung angesehen wird. Bei der wässrigen SEC zur Analyse von Proteinen steht insbesondere in der Qualitätskontrolle von biologischen Arzneimitteln nicht die Bestimmung der Molmasse, sondern die Quantifizierung der Komponenten (Wirkstoff, Verunreinigungen, Fragmente oder Aggregate) im Vor­dergrund. Hier werden Proteinstandards vor allem für Systemeignungstests verwendet. Die folgenden Beispiele zeigen, was bei der Wahl von Standards und Methodenparametern in der SEC beachtet werden sollte.



Abb.1 Kalibrierkurven von SEC Säulen für Proteintrennungen TSKgel SuperSW mAb HTP 4,6x150mm, TSKgel SuperSW mAb HR, TSKgel UltraSW Aggregate & TSKgel G3000SWXL, alle 7,8x300mm; mobile Phase: 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,7, 0,05% Natriumazid; Injektionsvol.: 10µL; Flussrate: 0,35ml/min (4,6mm ID), 1ml/min (7,8mm ID); UV @ 280nm; Probe: Protein Standard Mix 15–600kDa (Fluka P/N 69385, 15–600kDa (Thyroglobulin (640kDa), γ-Globulin (155kDa), Ovalbumin (47kDa), Ribonuclease A (13,7kDa), p-Aminobenzoesäure)

Die SEC-Kalibrierung

Da in der SEC Moleküle nur entsprechend ihres hydrodynamischen Volumens getrennt werden, sollten die Standardmoleküle und die zu analysierende Proben möglichst ähnlich sein. Daher sollten in der Proteinanalytik idealerweise Proteinstandards und nicht die in der wässrigen SEC üblichen Polyethylenglykolstandards genutzt werden. Ready-to-use-Kits wie der Fluka Protein-Standardmix für SEC sind einfach in der Anwendung und bieten eine gute Abdeckung des Molmassenbereichs, in dem viele therapeutische Proteine liegen, die üblicherweise mit ­TSKgel G3000SWXL oder TSKgel SuperSW mAb-Säulen analysiert werden. Ein Beispiel sind mono­klonale Antikörper (mAb) und deren Fragmente bzw. Di-/Trimere.



Abb.2 Einfluss der Probenmenge Säule: TSKgel SuperSW mAb RH, 7,8x300mm; Probe: Pro­tein Standard Mix 15–600kDa (Fluka); Injektions­volumina: 5–100µL; Standardkonzentration: 1x, 2x, 5x; Mobile Phase: 0,2M Natriumphosphat­puffer, pH 6,7 mit 0,2M Natriumsulfat. Flussrate: 1ml/min; UV @280nm.

Die Probe

Für die Qualität eines SEC-Chromatogramms sind neben der mobilen und stationären Phase auch die aufgebrachte Probenmenge und das Injektionsvolumen entscheidend. Durch Über­laden der Säule wird die Auflösung verringert und es kann zu Retentionszeitverschiebungen und damit zu falschen Molmassenbestimmungen kommen. In Abbildung 2 ist der Effekt unterschiedlicher Injektionsvolumina und Probenkonzentrationen auf die Trennung eines Protein­gemisches auf einer TSKgel SuperSW mAb HR- Säule gezeigt. Der Proteinstandard wurde dazu in 200µL (5x), 500µL (2x) und 1000µL (1x) Wasser gelöst. Bei der höchsten Konzentration und dem größten Injektions­volumen werden die Peaks nicht vollständig getrennt. Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig passende Injektionsvolumen und Probenkonzentration für die Trennung sind. Permanente Überladung kann darüber hinaus die Säule vorzeitig altern lassen. Eine 7,8 x 300 mm-SEC-Säule liefert die besten Ergebnisse, wenn die Probe in einem Volumen von bis zu 20µl mit einer Konzentra­tion von 1–5mg/ml aufgebracht wird.



Abb.3 Einfluss der mobilen Phase Mobile ­Phase: Natriumphosphatpuffer mit 0,2 M Arginin (rot), Natriumphosphatpuffer mit 0,2M Natriumsulfat (grau); Säule: TSKgel UltraSW Aggregate; Flussrate: 1ml/min; Probe: mAb 100µg; Injek­tionsvol.: 20µL; UV @ 280nm.

Die mobile Phase

Generell sollten bei Kalibrierungen oder System­eignungstests die gleichen Bedingungen wie bei der eigentlichen Analyse vorherrschen. Obwohl die mobile Phase in der SEC nicht so ­großen Einfluss auf die Retention hat wie bei adsorptiven Chromatografiemethoden, kann ein Wechsel des Puffersystems auch hier die Retention beeinflussen. Arginine wird z.B. gerne als Additiv bei der Analyse des Aggregatgehaltes von Antikörperpräparaten genutzt, da es Wechselwirkungen der hydrophoberen Antikörper­aggregate mit der stationären Phase verhindert. Abbildung 3 illustriert den Effekt der Zugabe von 200mM Arginine zur mobilen Phase für die Trennung eines aggregierten monoklonalen ­Antikörpers. Die Retentionszeitverschiebung durch Zugabe von Arginin würde z.B. eine Molmassenbestimmung verfälschen, wenn bei der Erstellung der Kalibrierung kein Arginin zugesetzt worden ist. Diese Beispiele zeigen, wie wichtig die Wahl der optimalen Säule, der Referenzstandards, der Methodenparameter und Probenmengen auch bei einer scheinbar einfachen Chromatografiemethode wie der Größenausschlusschromatografie ist. Die Wahl etablierter (U)HPLC-Säulen und Methoden erleichtert den Einstieg in die SEC-Trennungen von Proteinen.

L&M 1 / 2014

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 1 / 2014.
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