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Trennung von Steviolglykosiden
Trennung von Steviolglykosiden
Steviolglykoside sind verantwortlich für den süßen Geschmack der Blätter der Stevia-Pflanzen (ca. 200 Arten), die schon seit Jahrhunderten bei den Einwohnern von Brasilien und Paraguay bekannt sind. Die Süßkraft dieser Substanzen ist etwa 75- bis 450-fach stärker als die von Saccharose und sie zeigen auch nicht den bitteren Nachgeschmack vieler bekannter Süßstoffe. Steviolglykoside sind praktisch kalorienfrei und unterliegen keiner Zersetzung durch Mikroorganismen. Daher unterdrücken diese Substanzen auch die Bildung von Karies und Plaque.
Die vier wichtigsten Vertreter der Steviolglykoside in den Blätterextrakten sind das Steviosid mit einem Anteil von 5–10 %, das Rebaudiosid A mit einem Anteil von 2–4 %, das Rebaudiosid C mit einem Anteil von 1–2 % und das Dulcosid A mit einem Anteil von 0,5–1 % der gelösten Substanzen. Bisher sind die Steviolglykoside in der EU offiziell nicht als Lebensmittelzusatz zugelassen. Im Frühjahr 2010 wurde jedoch von der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) eine positive Bewertung zur Sicherheit von Steviolglycosiden veröffentlicht, die eine baldige Zulassung in der EU höchstwahrscheinlich macht. Daher wird eine robuste und sensitive Quantifizierungsmethode für gereinigte Stevia-Extrakte mit den 4 Steviolglykosiden benötigt.
Methode
Eine geeignete Methode zur Bestimmung der Steviolglykoside aus Pflanzenextrakten wird nachfolgend beschrieben.
Probenvorbereitung
Etwa 2 g getrocknete und gemahlene Stevia-Pflanzenblätter, genau gewogen, werden mit 20 ml Wasser bei 70 °C unter Rühren extrahiert. 1 ml dieser Mischung wird dann auf eine vorkonditionierte C2-SPEKartusche gegeben und mit Wasser sowie einer 20 %igen Methanolmischung gewaschen. Anschließend wird die Kartusche so lange mit 80 %igem Methanol gespült, bis ein Volumen von 62 ml erreicht wird.
Herstellung der Standardlösungen
Je 2,5 mg von Steviosid und Rebaudiosid A werden in einen 10 ml Messkolben gewogen, in einer kleinen Menge einer 80 %igen wässrigen Methanolmischung gelöst und der Kolben mit einer 80 %igen wässrigen Methanolmischung bis zur Marke aufgefüllt. Von dieser Stammlösung (250 ?g/ml) werden Verdünnungen der Konzentration 100 ?g/ml, 50 ?g/ml, 10 ?g/ml und 1 ?g/ml hergestellt.
Empfohlene Gerätekonfiguration
Diese Applikation benötigt ein isokratisches HPLC-System, welches mit einem Degasser, einem Autosampler, einem Säulenofen und einem PDA-Detektor ausgerüstet ist. Hier wurden ein Smartline HPLCSystem (Knauer) mit Smartline Pumpe 1000, inkl. 10 ml Pumpenkopf, ein Smartline Manager 5000 mit Degaser, ein SmartMix statischer Mischer, ein Autosampler 3950, ein Smartline Ofen 4050, ein Smartline PDA Detektor 2800, eine 10 mm Flusszelle und der ChromGate Software eingesetzt.
Ergebnisse
Im Folgenden sind die Ergebnisse der chromatographischen Trennung eines Stevia-Pflanzenextraktes und die über lagerten Chromatogramme der vier Steviolglykoside mit unterschiedlichen Konzentrationen dargestellt. Die schnelle Trennung erfolgte mit einer Europher NH2-Säule im RP-Modus (Smartline HPLC-System, Knauer); dabei wurden exzellente Peaksymmetrien erhalten. Die Eurospher NH2-Phase eignet sich ausgezeichnet, um sehr polare Substanzen im RP-Modus zu trennen und kann genauso als schwacher Anionentauscher verwendet werden. Weiterhin ist diese Phase auch für den Normalphasen- und den polar-organischen Modus geeignet.
Die hier beschriebene einfache isokratische Trennmethode mit sehr moderaten Methodenparametern ist sehr robust und empfindlich, auch über einen langen Analysenzeitraum. Dies verdeutlichen die in der Tabelle 1 aufgeführten Methodenergebnisse. Weiterhin ist die Auflösung zwischen den Zielanalyten und den auftretenden Matrixpeaks ausreichend groß. Die Methode kann daher auch für die quantitative Bestimmung dieser Zielanalyten in anderen Matrices eingesetzt werden.
Zusammenfassung
Eine robuste, selektive und empfindliche Trennmethode für die Bestimmung von vier Steviolglykosiden in Pflanzenblättern der Stevia-Pflanze wurde entwickelt. Abgesehen von zwei durch ihre Standards nachgewiesenen Substanzen wurden mittels LC–MS noch zwei weitere Glykoside in den Extrakten der Stevia-Blätter identifiziert. Diese beiden Substanzen wurden mit den Kalibrierfunktionen der bekannten Substanzen quantifiziert. Mit kurzen HPLC-Säulen und einem KNAUER Smartline HPLC System wurde eine schnelle und einfache Methode für die Trennung komplexer Stevia-Extrakte erstellt. Hierbei garantieren die gewählten Methodenparameter in Verbindung mit der etablierten Eurospher NH2-Phase eine sehr günstige und sehr gut reproduzierbare Analysenmethode.
borstel@knauer.net
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