Lichtmikroskopie jenseits des Abbe-Limits

Blinkende Moleküle

Mit dem diesjährigen Nobelpreis in Chemie ehrt das Nobelpreiskomitee die ­Erfinder von Superauflösungs-Mikroskopiemethoden. Die Entdeckungen von Eric Betzig, Stefan Hell und William Moerner waren in den letzten Jahren Grundlage für bahnbrechende Forschungsergebnisse in den Lebenswissenschaften, die mit herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie- methoden nicht möglich waren.

Abb.1 Die Abbe-Formel beschreibt die durch Beugung limitierte erreichbare Auflösung in der klassischen Lichtmikroskopie. Diese Grenze wird als Auflösungsgrenze oder Abbe-Limit bezeichnet.

Die fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (Photo­activated Localization Microscopy, PALM) wurd­e 2006 von Eric Betzig, Harald Hess und Kollegen entwickelt, um die Position einzelner Mole­küle mit einer Auflösung jenseits der von Ernst Abbe beschriebenen optischen Auflösungs­grenze zu bestimmen (Abb.1). Heute forschen beide am Howard Hughes Medical Institute des Janelia Research Campus in Ashburn, Virginia, USA.

Wenn in der Lichtmikroskopie fluoreszierende Proteine wie z.B. GFP zu nahe beieinanderliegen, können feine zelluläre Strukturen nicht mehr getrennt voneinander abgebildet werden, sie erscheinen als „Wolke“. PALM und verwandte­ Superauflösungs-Techniken (u.a. FPALM, STORM) nutzen daher eine Reihe von Tricks, um die maxi­mal mögliche Auflösung in der Fluoreszenzmikros­kopie erheblich zu steigern. Wichtigste Voraussetzung hierfür sind sogenannte fotoschaltbare fluoreszierende Proteine (photoswitchable fluorescent proteins, PS-FPs). In der Molekularbiologie werden diese PS-FPs an zelluläre Strukturen gebunden und selektiv zum „Blinken“ ge­bracht. Mit geringen Lichtintensitäten und spezifischen Wellenlängen werden nun sequenziell einige wenige PS-FPs zufällig aktiviert, das heißt auf „An“ gesetzt. Im Anschluss wird ein Bild mit einer leistungsfähigen Mikroskopkamera aufgenommen. Dadurch ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei eng benachbarte Moleküle gleichzeitig aufleuchten, sehr klein. Bereits leuchtende Moleküle werden durch Licht geeigneter Wellenlänge wieder inaktiviert, das heißt, sie gehen in den „Aus“-Zustand über. Um alle Moleküle zu erfassen, wird dieser Vorgang sehr häufig und schnell hintereinander wiederholt (Abb.2). Dabei können weit über tausend Einzelaufnahmen entstehen, bis alle PS-FPs endgültig in ihren „Aus“-Zustand konvertiert sind. Ab hier übernimmt dann der Computer: Durch spezielle Algorithmen lässt sich der Mittelpunkt der fluoreszierenden Molekül-„Spots“ genauestens lokalisieren. Damit­ sind die Positionen der einzelnen Moleküle exakt bestimmbar. Das fertige Bild in „Superauflösung“ besteht somit aus der Summe aller detektierten Einzelmoleküle in allen Einzelaufnahmen – ähnlich einem pointilistischen Kunstwerk. Weitere Entwicklungen der PALM-Methode ermöglichen heute 3D-Imaging mit Auflösungen von etwa 20 Nanometern in lateraler und 60 Nanometern in axialer Raumrichtung. Das ist das Zehnfache der mit klassischer Lichtmikroskopie erreichbaren Auflösung (Abb.3).

Das Abbe-Limit besteht immer noch, aber es lässt sich austricksen – dank brillanten Nobelpreisträgern wie Eric Betzig und ELYRA-Mikroskopen von ZEISS.

Mehr Informationen

// iBiology Seminar mit Eric Betzig & Harald Hess (Englisch)

http://youtu.be/GcQ24khZzvU

// ZEISS Imaging-System ELYRA

www.zeiss.de/elyra

// White Paper Sample Preparation for ­Superresolution Microscopy (Englisch)

http://bit.ly/elyra-protocols