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Neue HPLC-Phasen für die Analyse von Biopharmazeutika

Große Moleküle schnell analysiert

Schnelle Chromatographie mit hoher Auflösung – das Ziel aller Anwender in Forschung,
Qualitätskontrolle oder Prozesskontrolle. Entsprechend wurde in den letzten Jahren durch
die Entwicklung neuer Geräte und Reversed Phase-Säulen mit kleinen Partikeldurchmessern
eine beeindruckende Durchsatzsteigerung in der HPLC-Analytik erreicht. Diese Methoden werden jedoch vorwiegend für die Trennung kleiner organischer Moleküle eingesetzt. Die Analytik von Biopolymeren wurde dagegen vor allem durch neue Gerätetechnik im Bereich der Massenspektrometrie vorangetrieben. Neue stationäre Phasen für die typischen Chromato-graphiemodi der Bioanalytik ermöglichen nun auch Anwendern in der biopharmazeutischen Industrie schnellere chromatographische Trennungen von Biopolymeren.

Die Entwicklung und Produktion von Biopharmazeutika ist ein stetig wachsender Bereich der pharmazeutischen Industrie. Als aktuelles Beispiel sei nur die Impfstoffentwicklung
genannt – Stichwort ‚Schweinegrippe’. Rekombinante Proteine, von Insulinprodukten bis hin zu therapeutischen Antikörpern, sind eine weitere wichtige Gruppe von Biopharmazeutika. Inzwischen sind die ersten Nachfolgeprodukte, sogenannte ‚Biosimilars’, in Europa
eingeführt worden. Biopolymere sind hochkomplexe Moleküle und stellen entsprechend hohe Anforderungen an die Analysenmethoden. Therapeutische Proteine können zum Beispiel aufgrund posttranslationaler Modifikationen wie Desamidierung oder Glykosilierung eine gewisse Mikroheterogenität aufweisen. Da die Isoformen unterschiedliche biologische Aktivität und Stabilität aufweisen können, ist eine genaue Charakterisierung und Quantifizierung der Wirkstoffe unerlässlich.

Chromatographie von Biopolymeren

Ionenaustausch- (IEC) oder Größenausschluss-Chromatographie (SEC) sind die Methoden der Wahl für die Trennung von Proteinen in nativer Form. Typische Analysenzeiten
liegen hier meist über 30 Minuten oder gar im Stundenbereich. Wegen der Größe der Moleküle ist es nur bedingt möglich, die Analysenzeiten allein durch Verwendung
von Säulen mit kleineren Partikeln und entsprechender Optimierung des Systemtotvolumens zu verkürzen. Neue Techniken der Oberflächenmodifizierung,
die zuvor schon in den neusten Generationen der Prozessharze erfolgreich eingesetzt worden sind [TOSOH BIOSCIENCE], wurden nun auch für die Entwicklung neuer Ionenaustauscher Phasen für die HPLC genutzt. Diese stationären Phasen können sowohl zur Verkürzung der Analysenzeit als auch zur Erzielung einer höheren Auflösung eingesetzt werden.

Neue stationäre Phasen für die Ionenaustausch-Chromatographie

TSK-GEL STAT Phasen basieren auf nichtporösen, hydrophilen Polymerpartikeln, die mit einem Netzwerk funktioneller Gruppen auf der Oberfläche überzogen sind (Abb.1). Durch den nichtporösen Kern ist ein schneller Massentransport gewährleistet - die Voraussetzung für schmale Peaks, hohe Trenneffizienz und schnelle Chromatographie. Durch die spezielle Oberflächenmodifikation wurde die Dichte der funktionellen Gruppe auf dem Partikel so erhöht, dass die Kapazität im Vergleich zu anderen nichtporösen Phasen deutlich gesteigert wurde. Die Serie umfasst schwache und starke Kationenaustauscher
mit Carboxymethyl- bzw. Sulfopropylgruppen sowie starke Anionenaustauscher mit quaternären Ammoniumgruppen. Aus verschiedenen Säulen- und Partikeldimensionen
kann die optimale Säule für die geplante Anwendung ausgewählt werden: Kurze Säulen, gepackt mit 10 µm Partikeln für Hochdurchsatz-Analysen (Screening oder In-Prozess-Kontrolle), längere Säulen mit kleineren Partikeln für hohe Auflösungen. Auch diese
neuen Ionenaustauscher entfalten natürlich in einem Totvolumen-optimierten HPLC System die beste Leistung.

Anwendungen

Analyse von Isoformen monoklonaler Antikörper Ladungsvarianten von Proteinen, die z.B. durch Desamidierung der Asparagin- und Glutamin-Seitenketten entstehen, werden in der biopharmazeutischen Qualitätskontrolle üblicherweise mittels Kationenaus-tauschchromatographie getrennt und quantifiziert. Durch den Einsatz einer TSKgel CM-STAT Säule in 10 cm Länge, gefüllt mit 7 µm Partikeln des schwachen Kationenaustauschers, konnte die Analysenzeit hier fast halbiert werden. Abb. 2 zeigt Trennungen der Isoformen fünf verschiedener monoklonaler Antikörper auf einer für diese Analyse häufig verwendeten WCX Säule eines anderen Herstellers (B) und auf der TSKgel CM-STAT Säule (A) im Vergleich. Die Trennungen erfogten mit NaCl-Gradienten in 20 mM MES Puffer (pH 6.0). Teilweise konnte mit der kürzeren TSKgel CM-STAT Säule nicht nur die Analysendauer verringert, sondern auch die Auflösung verbessert werden (z.B. mAb A, siehe Abb. 2).

Monitoring von PEGylierungsreaktionen

Die PEGylierung, bei der biopharmazeutische Wirkstoffe mit Polyethylenglykol (PEG) gekoppelt werden, ist eine etablierte Methode, um die Proteine gegen den vorzeitigen
Abbau im Organismus zu schützen. Die Überwachung der PEGylierungsreaktion und die Kontrolle des Endproduktes können schnell und hocheffizient mittels IEC durchgeführt werden. Abbildung 3 zeigt das Monitoring einer PEGylierungsreaktion von ß-Lactoglobulin in 5 Minuten-Intervallen mit einer High-Throughput TSKgel SP-STAT Säule und einem schnellen NaCl-Gradienten in 20 mM Natriumacetatpuffer (pH 5.0) bei hoher Flussrate
(2 mL/min). Beim Reaktionsmonitoring wie auch bei anderen In-Prozess-Kontrollen liegt der Fokus naturgemäß auf der schnellen Überprüfung des Reaktionsfortschrittes in möglichst kurzen Intervallen. Die Trennung der Positionsisomere des Mono-PEG Produktes zur genaueren Charakterisierung des Endproduktes ist mit einer längeren Säule mit kleineren Partikeln und einem flacheren Gradienten möglich.

Fazit

Ob Optimierung der Analysenzeiten oder Verbesserung der Trenneffizienz gefordert werden, die Palette an unterschiedlichen Partikelgrößen, funktionellen Gruppen und Säulendimensionen der TSK-GEL STAT Ionenaustauschersäulen für die HPLC unterstützen die Methodenoptimierung in jede gewünschte Richtung. Basierend auf dem speziellen, neuentwickelten Partikeldesign sind weitere Produkte für die Biochromatographie in der Entwicklung.