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Blockierer im Vergleich

Qualität und Wirtschaftlichkeit jetzt in neuartigem Blockierer vereint

von Dr. Wolfram Marx

Die Blockierung in Immunoassays, also die flächige Absättigung freier Bindungsstellen von Oberflächen wie z. B. ELISA-Wells oder Western Blot Membranen, ist ein wichtiger methodischer Arbeitsschritt. Wer hierbei Fehler begeht, bezahlt dies meist mit einem Hintergrund, der das Ergebnis unbrauchbar macht oder schlicht ein falsches Ergebnis vorgaukelt. Daher gibt es ganz unterschiedliche Methoden der Blockierung, von denen sich nur wenige in den letzten Jahren aus gutem Grunde immer stärker etabliert haben. Vielfach bewährt haben sich dabei Protein-basierte Blockierer auf Casein- oder BSA-Basis. Gerade Casein-basierte Blockierer haben, allerdings nur wenn sie durch vielfache Spaltung des Caseins hergestellt werden, eine unerreicht gute Effizienz bewiesen. Immer wenn reproduzierbare Ergebnisse wichtig sind und auf niedrige Standard- Abweichungen Wert gelegt wird, gibt es kaum eine ernst zu nehmende Alternative. Leider ist die Herstellung aufwändig. Dies macht sie zu den etwas teureren, aber qualitativ auch nicht zu übertreffenden Blockierern. Jetzt stellen wir die neue Alternative Blocking Buffer II EGrade vor, die Qualität und Wirtschaftlichkeit vereint.

Stand der Technik

Wenn die zu vermessende Probe selten und teuer oder das Ergebnis aus anderen Gründen wichtig ist und wirklich vertrauenswürdig sein soll, dann gibt es zu hochreinen, mehrfach gespaltenen Casein- Blockierern (z. B. Applichem's Blocking Buffer I) keine Alternative. Die nächstbeste Stufe der Qualität stellt eine Blockierung auf Basis von hochreinem BSA dar. Die Effizienz ist in vielen Assays ähnlich gut. Unterschiede zeigen sich vor allem in den Messabweichungen in Assays mit Realproben (gemessen als Variationskoeffizient VK bei Mehrfach-Messungen). Diese Unterschiede sind hauptsächlich in der unterschiedlichen Größe der blockierenden Moleküle begründet. Bei dem relativ großen BSA bleiben Lücken, die bei der Messung von Proben, wie z. B. Zellkulturüberständen oder Blutserum, durch beliebige kleine Moleküle besetzt werden können. Viele dieser Substanzen stören im Ergebnis nicht. Manche interagieren aber z. B. mit Detektorantikörpern oder den an sie gebundenen Labeln, wie z. B. Peroxidase, Phosphatase oder Fluoreszenzfarbstoffen. Sobald solche Interaktionen auftreten, führen sie immer zu falschen Ergebnissen. Das Schlimme daran ist, daß man nie voraussagen kann, wann dies passiert, wie stark die Störungen sich auswirken und ob die Abweichungen das Ergebnis nach oben oder nach unten driften lassen. Doch wie bemerkt und erkennt man diese Störungen dann? Am einfachsten durch hohe Messabweichungen, also hohe VKs. Ein Beispiel für eine solche Störung, die bei Betrachtung des VKs erst deutlich wird, ist in Abb. 1 gezeigt. Es handelt sich um einen ELISA im Sandwich- Format, der zunächst auch bei Anwendung eines BSA-basierten Blockierungsreagenzes (Blocking Buffer III BSA) gut zu funktionieren schien. Doch die VKs sprechen eine andere Sprache. Was wie ein guter Assay im Ergebnis aussieht, entpuppt sich bei genauerem Hinsehen als unzuverlässig. Erst der Vergleich des gleichen Assays mit einer Blockierung mit AppliChem’s Blocking Buffer I zeigt ein zuverlässiges Ergebnis. Ein zunächst unscheinbarer Effekt, der im Endeffekt aber über die Aussagekraft aller dahinter liegenden Untersuchungen entscheidet. Denn meistens dienen die ELISA, Western Blots oder andere Immunoassays einfach nur als Werkzeug, um tiefer liegende Hypothesen in der Forschung zu bestätigen oder zu widerlegen. Wer hierzu nun ein unzuverlässiges Werkzeug, wie im gezeigten Beispiel diesen BSA-blockierten ELISA, nutzt, muss sich durchaus gefallen lassen, wenn die erhaltenen Ergebnisse in einem wissenschaftlichen Kontext hinterfragt oder bezweifelt werden – in diesem hier gezeigten Fall sind bei BSA-Blockierung Zweifel also durchaus angebracht.

ebenfalls nicht zu vernachlässigen. Es war über Jahre hinweg üblich, kleine Antigene – sog. Haptene – vor einer Immunisierung zur Antikörpergewinnung mit BSA als Trägermolekül zu koppeln. Dies funktioniert gut, zuverlässig und einfach. Es hat uns nur eine Unmenge von kommerziell gehandelten sowie unter Wissenschaftlern über Austausch verbreitete Forschungsantikörper in die Labore gespült, die neben den gewünschten Haptenen auch mit merklicher Affinität BSA binden. Denn es wurde ja auch mit bzw. gegen BSA immunisiert. Dies wäre solange kaum ein Problem, wenn alle Produzenten von Antikörpern, sowohl die Firmen als auch die in den Instituten, die selbst Antikörper generieren, diesen methodischen Schritt immer angeben. Dann wäre man gewarnt und wüsste vorab, wann man BSA-Blockierer verwenden darf und wann nicht. Doch das Gegenteil ist leider der Fall. Es hat sich seit Jahren bzw. Jahrzehnten eingebürgert bei Forschungsantikörpern kaum derartig wesentliche Angaben zu machen. Jeder neue Antikörper birgt daher diese experimentellen Risiken, die dazu führen, dass man ihn nur dann wirklich mit BSA im Assay einsetzen sollte, wenn der Produzent dies auch so angibt. Dennoch bleibt es Fakt, daß BSA in vielen Fällen ein sehr guter Blockierer ist. Er ist etwas preisgünstiger als optimale Casein- Blockierer, trotz der aufwändigen BSA-Gewinnung und Aufreinigung.
Den großen Vorteilen der schon genannten guten Protein-basierenden Blockierer stehen also leider auch gewisse Kosten gegenüber. Daher sucht man seit Jahren nach Alternativen – und es gibt viele davon. Fischgelatine oder Molkepulver, um nur zwei Beispiele zu nennen. Diese führen in manchen Laboren und Assays ein Nischendasein, in vielen anderen Assays versagen sie jedoch regelmäßig. In der medizinischen Forschung, z. B. bei Pharma-Assays, bei präklinischen oder klinischen Studien oder auch in der Diagnostik sind diese Blockierer kaum zu finden, denn die Reproduzierbarkeit ist schon aufgrund der unkontrollierbaren immer wieder schwankenden Rohstoffqualität überhaupt nicht gegeben. Wenn es auf einen Assay wirklich ankommt z. B. weil wichtige Rückschlüsse für Zwecke der medizinischen Forschung im Rahmen von Studien getroffen werden sollen, kann man sie also nicht in Betracht ziehen. Ein Assay kann nur reproduzierbar sein, wenn die Rohstoffe reproduzierbare Qualität haben. Aus Kostengründen kommen sie also nur dort zum Einsatz, wo man sich geringe Zuverlässigkeit leisten kann, weil es z. B. eher um die Ausbildung von Studenten geht, als um verlässliche Resultate. Hier haben diese Blockierer ihr sinnvolles Anwendungsfeld.

Alternativen sind wünschenswert

Die hochwertigen Blockierer sind also mit etwas höheren Kosten verbunden, die anderen sind günstiger und von stark schwankender Qualität. Es liegt auf der Hand, dass man versucht hat, die Vorteile beider Seiten zu verbinden. Das Ergebnis sollen die synthetischen Blockierer sein, von denen Tween??sicher der erste, bekannteste und wohl einfachste Vertreter ist. Aber auch eine Reihe anderer synthetischer Blockierer wird zu mitunter günstigen Preisen vertrieben. Die Reproduzierbarkeit der Rohstoffe dürfte hier immer optimal sein. Doch ein Problem wurde nicht gelöst. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Nicht ohne Grund haben die synthetischen Blockierer die Verwendung von Protein-basierten Blockierern überhaupt nicht zurückdrängen können, obwohl ihre Kosten nur einen Bruchteil betragen. Wenn man bedenkt, dass die Gesamtkosten der Blockierung nur im niedrigen Prozentbereich der Kosten eines gesamten Assays liegen (bei korrekter Kalkulation durch Einbeziehung der Personalkosten durch Arbeitszeiten eher im Promillebereich), dann wird klar, warum kaum einer gewillt ist, für diese Kosteneinsparungen auf Qualität zu verzichten. Daher möchten wir im Bereich der Blockierung eine neue Möglichkeit vorstellen, auf vernünftige Weise Kosten zu sparen. Der vollkommen neuartige Blockierer Blocking Buffer II EGrade bietet diese Möglichkeit. Für diese Lösung aus industrieller Herstellung, von einem nach DIN ISO 9001:2000 zertifizierten Produzenten, die frei von jeglichen Serumproteinen und Peptid-basiert ist, ist die Herkunft der Rohstoffe kontrolliert und die Blockierungseigenschaften von Charge zu Charge völlig einheitlich und reproduzierbar. Die Kosten sind geringer als bei Protein-basierten Blockierern. Die Qualität ist aber – anders als bei den synthetischen Blockierern – durchaus sehenswert, wenngleich nicht ganz so optimal wie bei Protein-basierten Blockierern wie Blocking Buffer I.

Analyt-unabhängiger Vergleich

Doch wie lässt sich nun tatsächlich die Blockierungseffizienz und Qualität eines neuen Blockierers verlässlich messen, sodass es nicht bei bloßen Vermutungen bleibt? Wir haben uns an den Arbeiten von Steinitz & Baraz (2000) und Steinitz (2000) methodisch orientiert, jedoch nicht die Phosphatase als Nachweisenzym, sondern die mittlerweile häufiger verwendete Peroxidase eingesetzt und die reine Betrachtung in Doppelbestimmung durch eine Achtfach-Bestimmung jedes einzelnen Messpunktes mit statistischer Betrachtung der Variationskoeffizienten (VKs) ergänzt. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden Blocking Buffer I als Blockierer basierend auf hochreinem und mehrfach gespaltenem Casein, Blocking Buffer III BSA als Blockierer auf BSA-Basis, der neuartige Blocking Buffer II EGrade sowie ein kommerzieller, synthetischer Blockierer verglichen. Auf jeweils blockierten Oberflächen in ELISA-Wells wurde (analog zu Steinitz (2000), jedoch mit Peroxidase) ohne weitere Zusätze ein Detektorantikörper inkubiert. Nach Waschen wurde die Farbreaktion durchgeführt. Je geringer hiernach die optische Dichte (OD) ist, desto besser die Blockierung. Die Abb. 2. zeigt die Ergebnisse bei Blockierung über Nacht. Alle Varianten zeigen Blockierung. Die Qualität ist bei Protein-Blockierern klar überlegen, gut bei Blocking Buffer II EGrade und immer noch gut beim synthetischen Produkt. In Abb. 2a sind die ODs aufgetragen, Abb. 2b zeigt ein Foto der blockierten ELISA-Platte. Hierbei ist auf der linken Seite in Spalte 1 die Kontrolle ohne jegliche Blockierung zu sehen. Die daneben liegenden Spalten sind analog zum Diagramm aufgetragen. Abb. 3 zeigt die Ergebnisse des gleichen Versuches, jedoch sind hier die VKs gezeigt. Hier trennt sich die Spreu vom Weizen offensichtlicher. Die in der ersten Betrachtung brauchbare synthetische Lösung zeigt, obwohl es sich um ein einfaches artifizielles System ohne Störkomponenten aus einer zu vermessenden Probe handelt, einen extrem hohen VK von fast 25 %. Ein solcher VK in der Blockierung überträgt sich auf den Gesamt- VK eines Assays gemäß der Fehlerfortpflanzung der jeweiligen Einzelfehler des Assays. Es erscheint damit fraglich, ob man einen reproduzierbaren Assay auf Basis dieser synthetischen Blockierung aufbauen kann. Sehr deutlich zeigt sich der Vorteil des neuartigen Blocking Buffer II EGrade. Die Blockierung ist sehr gut reproduzierbar. Der VK ist absolut identisch zu denen der hochwertigen Lösungen.
Durch die Kombination der Resultate von Abb. 2 und 3. lässt sich hieraus schließen, dass in jenen Assays, in denen Blocking Buffer II EGrade niedrigen Hintergrund ermöglicht, dies auch reproduzierbar gewährleistet ist. Dies ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber den sonst genannten Alternativen wie Fisch-Gelatine, Molke-Pulver oder wie gezeigt auch den synthetischen Blockierern. Diese sind für die geringe Ergebnis-Reproduzierbarkeit aus den genannten Gründen bekannt. Blocking Buffer II EGrade ermöglicht also die Kombination von Wirtschaftlichkeit und Reproduzierbarkeit für viele Assays. Aufgrund der gezeigten Kombination von guter Blockierung und hoher Reproduzierbarkeit gibt es damit erstmals eine echte Alternative zu den qualitativ hochwertigen Protein-Blockierern. Der erweiterte Vergleich nach Steinitz zeigt aber auch, dass selbst moderne Lösungen die Effizienz von hochwertigen Protein-Blockierern nicht erreichen und es daher in kritischen Anwendungen wie z. B. bei Pharma-Assays, Assays für Studien oder bei der Vermessung wertvoller Proben keine Alternativen gibt.

Fazit

Für viele Assays in den LifeSciences bietet AppliChem eine Alternative zu hochwertigen Protein-Blockieren. Blocking Buffer II EGrade hat das Potenzial, in vielen Forschungsanwendungen Wirtschaftlichkeit und gute Qualität zu verbinden.

w.marx@applichem.de