Die Aussagekraft unterschiedlicher Messverfahren am Beispiel der Analyse von Metaboliten in Rattenurin

Universell oder selektiv?

von Dr. Stephan Schröder

Die Analyse biologischer Proben stellt an die Messtechnik besondere Anforderungen, da oftmals die Konzentration der Analyten sehr klein ist im Verhältnis zu den Nebenkomponenten (Matrix). Darüber hinaus hat die Matrix u.U. auch einen störenden Einfluss auf die Qualität der Messungen. Dieser so genannte Matrixeffekt kann sich negativ auf die Nachweisgrenze und/oder die Reproduzierbarkeit der Messdaten auswirken.
Diesem Effekt kann man auf zwei Weisen begegnen: durch eine geeignete Probenvorbereitung, bei der die störende Matrix weitestgehend abgetrennt wird oder durch ein Messverfahren mit hoher Selektivität.f

Zwei Varianten im Vergleich

Bei der ersten Variante, bei der das Ziel ist, die Analyten gleichzeitig aufzureinigen und aufzukonzentrieren, muss man sich darüber im Klaren sein, dass jeder Schritt der Aufarbeitung auch einen Effekt auf die Analyten hat. Eine genaue Aussage über die Analyten in der Probe ist somit nur unter der Bedingung möglich, dass die Einflussgröße jedes einzelnen Aufarbeitungsschritts auf die Analyten exakt bekannt ist (bspw. Extraktionsverluste). Bei der zweiten Variante, bei der ein selektives Detektionsverfahren genutzt wird, macht man sich bestimmte Eigenschaften der Analyten zu Nutze, um sie im Analysengerät selbst von der Matrix abzutrennen und zu detektieren. Das hat den Vorteil, dass die Probenvorbereitung u.U. fast vollständig entfallen kann (z. B. Pyrolyse-GCMS oder Pestizidbestimmung mit QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)). Bei bestimmten Messverfahren kann gleichzeitig selektiv und universell analysiert werden, um so auch die Zusammensetzung der Matrix mitzubestimmen.
Ein Beispiel für ein universelles massenspektrometrisches Verfahren ist die MS-Messung im full scan Modus. Beispiele für selektive massenspektrometrische Verfahren sind die Messung im selected ion monitoring (SIM) oder multiple reaction monitoring (MRM) Modus bei MS/MS-Massenspektrometern. Für den Vergleich verschiedener Messtechniken wurde Rattenurin hinsichtlich einiger Metaboliten mit GCMS/MS in verschiedenen Messmodi analysiert.

Probenvorbereitung

Bei der Vorbereitung des Rattenurins zur Analyse mit GCMS wurde auf die Methode von Matsumoto et al. [1] zurückgegriffen. Diese Art der Probenvorbereitung (vergl. Abb. 1) ist schnell und einfach durchzuführen. Der Hauptvorteil ist jedoch der, dass es sich um einen so genannten planaren statt linearen Ansatz handelt. Das bedeutet, dass durch die Probenvorbereitung selbst praktisch keine Stoffgruppe diskriminiert wird, so dass simultan Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Zuckeralkohole und Nukleinsäurebasen mit einem GCMS analysiert werden können. Die Detektion der Analyten erfolgt nach Silylierung als Trimethylsilylderivat (TMS).

Instrumentelles Set-up

Die Messungen wurden auf dem GCMS Triple Quad GCMS-TQ8030 von Shimadzu durchgeführt. Dieses Triple-Quad-Massenspektrometer der neuesten Generation ermöglicht auf Grund der Scan-Geschwindigkeit von bis zu 20.000 amu/s und 600 MRM/s die zeitgleiche Aufnahme von full scan Daten und hochempfindlichen selektiven Einzelmassen (SIM) bzw. Massenübergängen (MRM). Die exakten Geräteinstellungen sind in einer Shimadzu-Applikationsnote veröffentlicht [2] und können über den Autor bezogen werden.

Untersuchte Metaboliten

Der Rattenurin wurde hinsichtlich folgender Metaboliten untersucht: Milchsäure-2TMS, Glycerol-3TMS, Glutarsäure-2TMS, Adipinsäure- 2TMS und Suberinsäure-2TMS. Milchsäure und Glycerol die-nen neben anderen als Marker für die Fruktose-1,6-Diphosphatase Defizienz, Glutarsäure für die Glutarazidurie Typ I und Adipin- bzw. Suberinsäure für die Glutarazidurie Typ II.

Vergleich der SIM- und MRM-Messungen

In der Abbildung 2 sind exemplarisch die Messungen der Glutarsäure und der Suberinsäure (jeweils als 2 Trimethylsilylderivat) im Urin von Ratten gezeigt. Glutarsäure ist sowohl im SIM- als auch im MRM-Modus gut mess- und auswertbar. Am Beispiel der Suberinsäure wird deutlich, dass die Selek-tivität der SIM-Messung nicht ausreicht, um eine verlässliche quantitative Aussage treffen zu können.

Messungen im Scan/MRM-Modus

Abbildung 3 zeigt den Totalionenstrom einer Messung, bei der simultan full scan und MRM-Daten aufgezeichnet wurden. Die Metaboliten Glutarsäure-2TMS und Adipinsäure-2TMS sind dank der Selektivität der MRM-Übergänge trotz der hohen Matrixfracht leicht und störungsfrei zu detektieren. Durch die simultane Aufnahme von full scan Daten, die automatisch gegen 179 Komponenten einer GCMS Metabolit Bibliothek abgeglichen wurden, konnten über die im MRM-Modus analysierten Metaboliten hinaus zwei weiter Metaboliten detektiert werden.
Bei dem Peak mit der Markierung *1 in Abb. 3 handelt es sich um Uracil-2TMS. Uracil dient neben anderen Substanzen als Marker für Funktionsstörungen im Harnstoffzyklus. Der Peak mit der Markierung *2 in Abb. 3 repräsentiert Apfelsäure-3TMS. Apfelsäure dient neben anderen Substanzen als Marker für mitochondriale Dysfunktionen oder auch Funktionsstörungen im Citratzyklus. Die extra-hierten Massenspuren und full scan Spektren sind in Abbildung 4 und 5 dargestellt.

Ergebnis

Bei biologischen Proben mit extrem hoher Matrixfracht zeigt sich die Stärke von selektiven analyti-schen Verfahren wie GCMS-SIM oder GCMS/MS-MRM. Sie liefern exzellente Ergebnisse, da sie gleichzeitig empfindlich und reproduzierbar sind. Ein wertvoller Nebeneffekt selektiver Messverfahren ist, dass die Probenvorbereitung auf ein Minimum reduziert werden kann. Dadurch spart man Zeit und nimmt wenig Einfluss auf die Probe selbst. Der aktuelle Stand der Messtechnik kombiniert selektive mit universellen Messverfahren, so dass in einem Lauf hochempfindlich quantifiziert und zeitgleich die Matrix überwacht werden kann, weil man nie wirklich sicher sein kann, ob die Matrix nicht doch einen interessanten Analyten enthält.

Foto: © Dr. Stephan Schröder