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BioChromatografie

Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern

Biopharmazeutika – gentechnisch hergestellte Arzneimittel – ermöglichen die Behandlung komplexer Erkrankungen wie Krebs oder Autoimmunerkrankungen. Inzwischen sind die ersten Biopharmazeutika patentfrei geworden und einige Nachfolgeprodukte (Biosimilars) sind bereits zugelassen. Dies erhöht den Druck, die Produktion von gentechnisch hergestellten Wirkstoffen effizienter zu gestalten.

Fortschritte in der Gentechnik und Zellkultur-Technologie haben die Expressionsraten rekombinanter Proteine in Zellkulturen (Upstream Prozess) enorm gesteigert. Im Gegensatz zur chemischen Produktion von kleinen Arzneimittelwirkstoffen ist jedoch bei Biopharmazeutika die Aufreinigung des Proteins aus dem Zellkulturlysat besonders aufwändig. Expressionsraten von bis zu zehn Gramm Zielprotein pro Liter erfordern hocheffiziente und robuste Aufreinigungsprozesse (Downstream Prozess, DSP). Während der Entwicklung biopharmazeutischer Herstellungsprozesse müssen optimale Bedingungen für jeden einzelnen Prozessschritt ermittelt werden. Die statistische Versuchsplanung (Design of Experiments/DoE) und robotergestützte Screeningverfahren (high throughput screening/HTS) sind wichtige Hilfsmittel für das Screening von stationären Phasen und Methodenparametern.

Aufreinigen monoklonaler Antikörper

Monoklonale Antikörper (mAbs) gehören zu den Biopharmazeutika mit dem größten Umsatzwachstum. Zur großtechnischen Aufreinigung von Antikörpern werden meist drei unterschiedliche Chromatografiemodi kombiniert. Im ersten, dem sogenannten Capture-Schritt, wird üblicherweise die Protein A-Affinitäts-Chromatografie eingesetzt. Dabei nutzt man die spezifischen Wechselwirkungen zwischen Immunglobulinen und immobilisiertem, rekombinantem Protein A. Um eine hohe Reinheit zu erzielen, wird die Protein Aaffintiäts- Chromatografie kombiniert mit anderen Chromatografie- und Retentionsmodi – wie Kationenaustausch, Anionenaustausch oder hydrophober Interaktion (HIC). Im Jahr 2009 veröffentlichte die CMC Biotech-Arbeitsgruppe die „A-mAb-Fallstudie“, ein Projekt mehrerer großer Biopharmaka-Hersteller zur Evaluierung eines Quality-by-Design (QbD)-Ansatzes am Beispiel des monoklonalen Antikörpers A-mAb – einem humanisierten IgG1 [1]. Typische Prozesse in der Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers, einschließlich des Upstream- und Downstream-Prozesses, wurden charakterisiert.

Harze für die Prozesschromatografie

Zur Aufreinigung von rekombinanten Proteinen kann eine breite Palette von stationären Phasen eingesetzt werden. Die Basismaterialien reichen von relativ weichen Agarosegelen über poröses Glas oder harten Polymeren bis hin zu Kieselgel. Neben Bindekapazität, Reinheit und Robustheit gegenüber der Reinigung (Cleaning-inplace/CIP) sollten bei der Auswahl des geeigneten Chromatograhieharzes auch dessen mechanischen Eigenschaften beachtet werden. Die Härte des Chromatografieharzes beeinflusst sowohl das Säulenpacken als auch die Bettstabilität in großtechnischen Industriesäulen bei hohen Flussgeschwindigkeiten. Toyopearl® Harze basieren auf einem hochvernetzten, relativ harten Polymethacrylat. Ihre hohe mechanische Stabilität führt zu ausgezeichneten Druck-Fluss-Eigenschaften (Abb. 1) und ermöglicht ein unkompliziertes Säulenpacken. Mit der Einführung des ersten Protein A-Sorbens auf der Basis von Toyopearl, Toyopearl AF-rProtein A-650F, kann nun ein komplettes downstream Processing für Antikörper auf der Basis von Toyopearlharzen etabliert werden. Ausgehend von den Ergebnissen der CMC-Studie wurden mAb-Aufreinigungsschritte mit Hilfe von HTS Verfahren und statistischer Versuchsplanung evaluiert. Kleine, mit verschiedenen Sorbentien gefüllte Screening-Säulen im Mikrotiterplatten-Format wurden mit Robotern für parallele Chromatografie in wenigen Stunden prozessiert [2]. Dies ermöglicht ein schnelles Screening und eine schnelle Optimierung der Verfahrensparameter.

Protein A-Affinität

Toyopearl AF-rProtein A-650F besitzt auch bei hohen Flussraten und bei Beladung mit hochkonzentrierten Ausgangsstoffen eine hohe dynamische Bindekapazität für IgG (Abb. 2) und ist damit gut geeignet für die Effizienzsteigerung des mAb-Capture- Schritts. Der rekombinante Ligand, der aus einer Untereinheit des Protein A entwickelt wurde, ist durch mehrere stabile Bindungen an die Polymermatrix gebunden. Dies verringert das Liganden-Bluten und erhöht die Stabilität gegenüber alkalischen CIP-Bedingungen. Verschiedene Protein A Affinitätsgele, Toyopearl AF-rProtein A-650F eingeschlossen, wurden in MediaScout® MiniSäulen (Atoll GmbH, Weingarten) unter Variation von Bindepuffer-pH-Wert, Beladung und Verweilzeit getestet. Zur Simulation einer realen Probe wurde ein CHO-Zellkulturlysat (chinese hamster ovary) mit reinem monoklonalen Antikörper (IgG1) versetzt und Reinheit und Wiederfindung des Antikörpers im Eluat bestimmt. Die Reinheit der Antikörperfraktion wurde mit Hilfe von Immunassays für die CHO-Zellproteine (host cell proteins/HCP) und für abgelöstes Protein A bestimmt. Mit Toyopearl AF-rProtein A-650F gereinigte Fraktionen zeigten bei Variation der Probenladung und/oder Flussrate (Verweilzeit) unter allen getesteten Bedingungen eine geringere Menge an verbliebenen CHO-Proteinen im Vergleich zu Fraktionen, die mit einem anderen gängigen rProtein A-Gel mit vergleichbarer IgG-Bindekapazität erhalten wurden. Dieser Reinigungsschritt kann im industriellen Maßstab mit dem neuen Protein A Medium folglich nicht nur bei höheren Flussraten durchgeführt werden, er liefert darüber hinaus auch eine höhere Reinheit.

Ionenaustausch-Chromatografie

Die Verringerung der CHO-Proteine (CHOP) wurde auch für einen Kationenaustauscher- Schritt unter Veränderung der Parameter Proteinladung und pH-Wert sowie Ionenstärke von Binde- und/oder Elutionspuffer bewertet. Bei niedrigem pH-Wert des Bindepuffers hat die Ionenstärke des Elutionspuffers (dargestellt als Leitfähigkeit) keinen signifikanten Einfluss auf die Menge der vom Kationenaustauscher (Abb. 3) eluierenden Zellproteine. Mit zunehmendem pH-Wert des Bindepuffers bis zu neutralen pH-Werten ist ein wachsender Einfluss der Ionenstärke auf das Entfernen der Zellproteine zu beobachten.

DSP-Durchsatz steigern

Künftige Herausforderungen der industriellen Antikörperreinigung werden in weiter steigenden Zellkulturtitern liegen. Die Produktivität des Prozesses wird dann vor allem durch die Kapazität der chromatographischen Reinigungsverfahren begrenzt werden. Toyopearl Harze mit hoher mechanischer Stabilität und hoher Proteinbindekapazität ermöglichen es, chromatographische Aufreinigungsschritte mit einer großen Bandbreite an Fließgeschwindigkeiten und Proteinbeladungen durchzuführen. Dies erweitert den Anwendungsbereich bestehender Aufreinigungsplattformen und erhöht die Effizienz und Wirtschaftlichkeit der Proteinaufreinigung in der biopharmazeutischen Produktion.

regina.roemling@tosoh.com