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Was steckt drin? – moderne DNA-Analytik zur Speziesbestimmung

Pferd im Rind

Die Lebensmittelbranche hat schon einige Krisen hinter sich: EHEC, Hormone und Antibiotika im Fleisch, Dioxine in Eiern. Nun gibt es einen aktuellen Fleischskandal, der in den letzten Tagen nicht nur die Medien in Großbritannien und Irland beherrschte. Pferdefleisch wurde in den verschiedensten Produkten wie Burger oder Fertig-Lasagne gefunden. Schnell wurde klar, dass der Skandal europaweite Kreise zieht und auch Deutschland betroffen ist. Obwohl diesmal hauptsächlich Rindfleischprodukte betroffen sind, können unabsichtliche oder absichtliche Beimischungen bis hin zur kompletten Substitution mit Produkten von minderer Qualität in allen Bereichen der Lebensmittelbranche auftreten. Wie kann die Laboranalytik Industrie und Verbrauchern helfen?

Schäden durch Fehlkennzeichnung

Ein weiteres aktuelles Beispiel sind falsch gekennzeichnete Fischarten: bis zu 40 % waren nicht richtig etikettiert [1, 2, 3], was neben Betrugsabsichten auch auf der Schwierigkeit beruht, ähnliche Fischspe zies in der Produktionskette zu differenzieren. Die Lebensmittelindustrie leidet unter dem Imageverlust und den beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden durch Rückrufaktionen und negative Schlagzeilen. Für den Verbraucher gibt es kaum Möglichkeiten, die Richtigkeit der Kennzeichnung zu überprüfen. Besonders kritisch wird dies, wenn die falsche Bezeichnung mit gesundheitlichen Risiken assoziiert ist wie die Kontamination mit toxischen oder allergieauslösenden Substanzen. Auch religiöse oder ethische Aspekte können bei Konsumenten ein gewichtiger Aspekt sein, bestimmte Tierarten nicht zu verzehren. Moderne Laboranalytik kann Spuren von unzulässigen Rückständen nachweisen oder auch die Echtheit eines Produkts belegen. DNA-Analysen kommen zum Einsatz, wenn es darum geht festzustellen, welche Tier- oder Pflanzenarten in einem Produkt enthalten sind. Der Vorteil: DNAAnalysen können auf jeder Stufe vom Rohmaterial zum fertigen Produkt und für jede Art von biologischem Material angewendet werden. Damit stellen sie ein wichtiges Werkzeug der Qualitätskontrolle dar.

DNA-Analyik ist der Goldstandard

Der Goldstandard für die Artenbestimmung von Tieren, Pflanzen und Mikro organismen ist immer noch die klassische DNA-Sequenzierung nach Sanger [4]. Dazu werden in der Regel kurze DNA-Abschnitte aus dem mitochondrialen (mt) Genom verwendet (z. B. Cytochrom B, Cytochromoxidase I [5, 6]). Mit universellen Primern, die speziesübergreifend an eine bestimmte DNARegion binden, kann eine breite Palette an Arten detektiert werden, die beispielsweise einer definierten evolutiven Gruppe wie den Säugetieren oder Knochenfischen angehören. Die Methode ist zudem sehr sensitiv, da die Kopienzahl der mtDNA die des Kerngenoms hundert- bis tausendfach übersteigt. Durch die geschickte Auswahl von kurzen DNA-Fragmenten können selbst Produkte, die durch diverse Verarbeitungsprozesse wie starkes Erhitzen in hohem Maß degradierte DNA enthalten, erfolgreich getestet werden [7]. Letztendlich können selbst geringe Beimischungen einer zweiten Spezies noch erfasst werden. Welchen Anteil die jeweilige Art relativ zur Gesamtprobe liefert, lässt sich mit dieser Methode allerdings nicht klären. Auch komplexe Mischungen mit mehr als zwei bis drei Spezies können schwierig zu bestimmen sein, da sich die Sequenzen der einzelnen Arten überlagern. Eine zweite DNA-Methode, die Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), erweitert das analytische Spektrum. Mit der RT-PCR können auch komplexe Mischungen auf definierte Arten überprüft und quantifiziert werden. Mittels speziesspezifischen DNA-Primern wird in der PCR für jede Art ein bestimmter Genabschnitt amplifiziert. Während der PCR lagert sich ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green) an die neu synthetisierten doppelsträngigen DNAFragmente an. Die Zunahme der Ziel-DNA in den Zyklen geht so mit einer Zunahme der Fluoreszenz einher. Am so genannten „crossing point“ (Cp-Wert) übersteigt das gemessene Signal signifikant das Hintergrundsignal der Fluoreszenz. Je weniger DNA-Zyklen durchlaufen werden, um den Cp-Wert zu erreichen, umso mehr DNA war in der Ausgangslösung enthalten. Die Berechnung erfolgt durch den Vergleich mit einem DNA-Standard mit bekannter Konzentration, der bei jeder Reaktion mitgemessen wird. Durch die Kombination verschiedener speziesspezifischer Primerpaare können so mehrere Arten auf einmal detektiert und quantifiziert werden. Zum Beispiel lässt sich damit in einem Hackfleischgericht feststellen, ob Pferd, Rind, Schwein, Schaf oder Huhn enthalten sind und zu welchen ungefähren Anteilen. Das Testsystem ist flexibel erweiterbar und kann für weite Bereiche angewendet werden. Im Vergleich zur Sequenzierung ist diese Methode noch deutlich sensitiver, erfordert jedoch eine genaue Vorauswahl der zu testenden Arten. Für die Quantifizierung der jeweiligen Anteile im Lebensmittel sind sehr sorgfältige Eichreihen notwendig, um die Zuverlässigkeit der Messungen zu gewährleisten. Eine noch höhere Spezifität erreicht man durch die Verwendung von Primer/Probe-Verfahren. Hier wird statt des Fluoreszenzfarbstoffs, der allgemein an doppelsträngige DNA bindet, eine artspezifische DNA-Sonde (Probe) an den DNAStrang angelagert, die fluoreszenz-markiert ist. In der Verlängerungsphase der PCR wird die Probe abgespalten und die Fluoreszenz steigt an.

Proteinanalytik und genetischer Fingerabdruck

Mit der Analyse von repetitiven genetischen Elementen, den Short Tandem Repeats (STR-Marker, Fragment-Längenanalyse), kann bei ausreichender DNA-Qualität sogar ein individuelles DNA-Profil von einem Lebewesen erstellt werden. Der DNA-Fingerabdruck, der in der DNA-Forensik spektakuläre polizeiliche Ermittlungserfolge erlaubt, kann auch in der Qualitätskontrolle der Lebensmittelproduktion eingesetzt werden. Beispiele sind der Nachweis der Erzeugung von Formfleisch, in dem dann mehrere individuelle Schweine nachgewiesen werden, oder das stichprobenartige Testen der Zuverlässigkeit von Nachverfolgbarkeitssystemen in der Tierproduktion – vom Stall bis in den Supermarkt. Neben DNA-Methoden können auch proteinbasierte Methoden wie ELISA-Tests (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) zur Speziesbestimmung herangezogen werden. Hierbei handelt es sich um ein antikörperbasiertes Nachweisverfahren. Ein spezifischer Antikörper bindet dabei an die nachzuweisende Substanz, das Antigen. Ein zweiter Antikörper, der an ein Enzym gekoppelt ist, führt zu einer Farbreaktion. ELISA-Tests sind schnell und preisgünstig, können aber eventuell nicht für jede Art von Probe angewendet werden.

Ausblick und Fazit

Die hochparallele DNA-Sequenzierung bis hin zur Einzelmolekülsequenzierung haben sich in den Laboren von Forschung, Industrie und Dienstleistern bereits etabliert. Das Next-Generation-Sequencing lässt sich auch zum sensitiven Nachweis von Lebensmittelverfälschungen einsetzen. Die kosteneffiziente Etablierung dieser brandneuen Analytik, die in einem Experiment bereits Terabytes an Daten erzeugt, steht aber noch aus. Auch Hochdurchsatzplattformen zur Analytik von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) eignen sich für den Speziesnachweis. Die moderne DNA-Analytik hält ein breites Spektrum für den Nachweis von Tier- und Pflanzenarten auch in prozessierten Lebensmitteln bereit. Die Methoden finden darüber hinaus Anwendung beim Nachweis von meist mikrobiellen Pathogenen wie E.coli (EHEC). Vorteile der DNAAnalytik sind die hohe Geschwindigkeit und die Spezifität bis hin zur Erkennung der genetisch determinierten Pathogenität und sogar Resistenz. Der Werkzeugkasten für die Erkennung von Lebensmittelverfälschungen für die Qualitätssicherung und Kontrolle bei der Lebensmittelerzeugung ist somit gut gefüllt.

Literatur
[1] Trade secrets: Renaming and mislabeling of seafood. Jacqeut, J.L., Pauly, D.; Marine Policy (2008) 32(3): 309-318. [2] Smoke, mirrors, and mislabeled cod: poor transparency in the European seafood industry. Miller, D. D., Mariani, S. (2010); Frontiers in Ecology and the Environment, December, Vol. 8, No. 10 : 517-521. [3] Misleading the masses: detection of mislabelled and substituted frozen fish products in South Africa. von der Heyden, S., Barendse, J., Seebregts, A. J., Matthee, C. A.; ICES J. Mar. Sci. (2010) 67 (1): 176-185. [4] DNA sequencing: bench to bedside and beyond. Hutchison CA III (2007) Nucleic Acids Res 35: 6227–6237. [5] Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species.Hebert , P. D. N. , Ratnasingham S., deWaard., J. R.; Proc. R. Soc. Lond. B (2003); (Suppl.) 270: S96–S99. [6] Species identification by means of the cytochrome b gene. Parson W, Pegoraro K, Niederstätter H, Föger M, Steinlechner M.; Int J Legal Med. (2000);114(1-2):23-8. [7] Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals. Hsieh H.M. a, Chiang H.-L. Tsai, L.- Ch., Lai, S.-Y., Huang, N.-E., Linacre, A., Lee, J. Ch.-I.; For. Sci. International (2001), Vol 122 (1):7-18.

L&M 2 / 2013

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 2 / 2013.
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